【摘要】：背景：鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌引起的自然疫源性疾病，在人類歷史上曾經(jīng)多次暴發(fā)流行。在感染宿主的過程中，鼠疫菌必須及時(shí)調(diào)整以適應(yīng)外部環(huán)境壓力同時(shí)維持其毒力和致病性，這些調(diào)整過程伴隨著鼠疫菌基因調(diào)控的變化。毒力調(diào)節(jié)因子通過毒力調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)對各個(gè)靶基因的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)或下調(diào)，其中調(diào)節(jié)因子Hfq和CRP的調(diào)節(jié)過程在毒力調(diào)節(jié)過程中起著特別重要作用。Hfq是sRNA分子伴侶，介導(dǎo)sRNA與靶mRNA之間的相互作用，基因hfq的缺失會導(dǎo)致鼠疫菌毒力的下降。環(huán)化腺苷單磷酸受體蛋白（CRP）在碳源代謝產(chǎn)物抑制過程中起重要作用，是鼠疫菌在宿主體內(nèi)生存繁殖過程中根據(jù)外部碳源調(diào)整自身代謝途徑以及能量代謝過程的核心因子；Crp基因的缺失會導(dǎo)致鼠疫菌毒力的減弱。本實(shí)驗(yàn)希望對鼠疫菌毒力調(diào)節(jié)的兩個(gè)因子Hfq和CRP的作用機(jī)制進(jìn)行研究。 方法：采用基于-Red重組系統(tǒng)的基因突變方法，分別突變鼠疫菌基因hfq和crp，構(gòu)建鼠疫菌hfq突變株（hfq）和crp突變株（crp）。對Hfq研究方面，，通過表型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證鼠疫菌hfq基因的缺失對生物膜形成的總體影響。通過-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)反映Hfq對各靶基因轉(zhuǎn)錄啟動水平的調(diào)節(jié)情況。通過引物延伸實(shí)驗(yàn)反映各靶基因轉(zhuǎn)錄至mRNA水平受Hfq影響。在比較hms各個(gè)基因翻譯至蛋白水平的變化方面，先將hms各個(gè)基因重組表達(dá)并免疫兔子得到多抗，再進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)。使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了鼠疫菌野生株、 hfq株和C-hfq株胞內(nèi)c-di-GMP的水平。對CRP研究方面，通過生長曲線和不同的培養(yǎng)基比較了鼠疫菌野生株和crp生長情況的差異。通過引物延伸實(shí)驗(yàn)和-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了CRP對其自身基因和編碼腺苷酸環(huán)化酶的基因（cyaA）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。使用電泳遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）和DNA酶Ⅰ足跡實(shí)驗(yàn)得出了CRP對其自身基因和編碼腺苷酸環(huán)化酶基因的結(jié)合位點(diǎn)。比較了鼠疫菌野生株和crp株胞內(nèi)cAMP的濃度。 結(jié)果：對于Hfq因子，在質(zhì)粒pCD1存在的情況下，Hfq對生物膜形成過程起正調(diào)節(jié)作用；而在缺失質(zhì)粒pCD1的情況下，Hfq對生物膜形成過程起負(fù)調(diào)節(jié)作用。-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)表明，Hfq對hmsP基因的轉(zhuǎn)錄啟動為負(fù)調(diào)節(jié)作用，對hms其他基因在轉(zhuǎn)錄啟動沒有作用。引物延伸實(shí)驗(yàn)表明，在轉(zhuǎn)錄后的mRNA水平Hfq對hmsHFRS，hmsT基因是正調(diào)節(jié)，對hmsP基因是負(fù)調(diào)節(jié)，對hmsD基因無調(diào)節(jié)。Western blot實(shí)驗(yàn)表明，在轉(zhuǎn)錄后蛋白水平Hfq對hms各基因調(diào)節(jié)結(jié)果同其在mRNA水平的調(diào)節(jié)結(jié)果。對于CRP因子，基因crp的缺失導(dǎo)致鼠疫菌生長受到影響， crp株生長速率以及平臺期菌濃度均低于野生株。-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)表明，CRP對自身基因的轉(zhuǎn)錄啟動無調(diào)節(jié)，而對基因cyaA負(fù)調(diào)節(jié)。引物延伸實(shí)驗(yàn)顯示，CRP對基因crp的mRNA無調(diào)節(jié)，而對基因cyaA負(fù)調(diào)節(jié)�；騝rp的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為A（-285），基因cyaA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為G（-133）。電泳遷移阻滯實(shí)驗(yàn)和DNA酶I足跡實(shí)驗(yàn)證明，CRP對基因cyaA有直接結(jié)合作用。胞內(nèi)環(huán)化腺苷單磷酸（cAMP）濃度的測定進(jìn)一步證實(shí)CRP對基因cyaA的負(fù)調(diào)節(jié)作用。 結(jié)論：本研究對鼠疫菌中兩個(gè)毒力調(diào)節(jié)因子Hfq和CRP在各自的毒力調(diào)節(jié)途徑——生物膜的形成和腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)，分別進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：質(zhì)粒pCD1的存在對Hfq調(diào)節(jié)生物膜的過程有較大影響，在質(zhì)粒存在的情況下Hfq對生物膜是正調(diào)節(jié)，在質(zhì)粒缺失的情況下Hfq對生物膜是負(fù)調(diào)節(jié)。Hfq通過轉(zhuǎn)錄后方式正調(diào)節(jié)hmsHFRS，hmsT，通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后方式負(fù)調(diào)節(jié)hmsP，共同調(diào)節(jié)生物膜形成，hmsD在本實(shí)驗(yàn)條件下不參與Hfq調(diào)節(jié)生物膜的過程。CRP對其自身基因無調(diào)節(jié)，并且不作用于自身基因啟動子區(qū)。CRP結(jié)合于編碼腺苷酸環(huán)化酶的基因（cyaA）啟動子區(qū)的-10序列附近，并且抑制其轉(zhuǎn)錄。CRP通過作用于腺苷酸環(huán)化酶基因來抑制cAMP的產(chǎn)生，這代表了鼠疫菌中CRP負(fù)反饋?zhàn)哉{(diào)節(jié)的一種機(jī)制。
[Abstract]:BACKGROUND: The plague is a natural infectious disease caused by Yersinia pestis. In the process of infecting the host, the Yersinia pestis must be adjusted in time to adapt to the external environment pressure while maintaining its virulence and pathogenicity, which are accompanied by changes in the regulation of the Yersinia pestis genes. The regulation factors of the regulation factors, such as Hfq and CRP, play a particularly important role in the regulation of virulence. Hfq is a sRNA molecular chaperone, which mediates the interaction between sRNA and the target mRNA, and the deletion of the gene hfq results in a decrease in the virulence of the Yersinia pestis. The cyclic adeno-monophosphate receptor protein (CRP) plays an important role in the inhibition of carbon source metabolism products, and is a core factor for the regulation of the metabolic pathway and energy metabolism of the Yersinia pestis according to the external carbon source in the survival and reproduction process of the host. The deletion of the Crp gene can lead to a decrease in the virulence of the Yersinia pestis. The effects of two factors, such as Hfq and CRP, on the virulence regulation of Yersinia pestis were studied in this experiment. Methods: The hfq and crp mutants of Yersinia pestis (hfq) and crp mutants (crp) were constructed by mutation of hfq and crp of Yersinia pestis by mutation method based on-Red recombinant system. In the aspect of hfq, the total shadow of the formation of the biofilms by the deletion of the hfq gene of the yersinia pestis was verified by a phenotypic experiment. The response of Hfq to the transcriptional initiation level of each target gene was reflected by the activity of the-galactooligosaccharide. In which the transcription of each target gene to the mRNA level is reflected by the Hfq shadow by a primer extension experiment. In response to that change of the translation of the individual gene of hms to the level of the protein, the hms gene is recombinantly express and the rabbit is immunized to obtain multi-resistance, and western blot is carried out. The c-di-GMP water of the wild strains, hfq and C-hfq strains of Yersinia pestis were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry. In that study of CRP, the difference between the growth of the wild strain and the crp of Yersinia pestis was compared by the growth curve and the different culture medium. The gene (cyaA) transcriptional regulation of CRP on its own gene and the encoding of the adenoid acid cyclase was verified by the primer extension experiment and the activity of the-galactosyenase. Using an electrophoretic mobility experiment (EMSA) and a DNA enzyme I footstep experiment, the binding site of CRP to its own gene and the gene of the encoded adenoid acid cyclase was obtained. Points. The concentration of cAMP in the wild and crp strains of Yersinia pestis was compared. Results: In the presence of pCD1 of plasmid pCD1, Hfq plays a positive role in the process of biofilm formation. In the absence of plasmid pCD1, Hfq has a negative effect on the process of biofilm formation. The results showed that the transcription of hmsP gene was negatively regulated by Hfq, and the other genes of hms were not activated by transcription. The primer extension experiment shows that the hmsHFRS and hmsT gene are positive and the hmsP gene is negative regulated, and the hmsD gene is expressed by the primer extension experiment. The results of Western blot show that the regulation of hms of hms in the post-transcriptional protein level (hfq) is related to the level of mrna. The results showed that, for CRP, the deletion of gene crp results in the growth of Yersinia pestis, the growth rate of crp and the concentration of bacteria in plateau. Wild plant.-Galactomase activity experiment shows that CRP has no regulation on the transcription initiation of its own gene, and the gene cyaA Negative regulation. The primer extension experiment shows that the CRP has no regulation of the mRNA of the gene crp, and the gene cyaA The transcription initiation site of the gene crp is A (-285), and the transcription initiation site of the gene cyaA is G (-1). 33). The experiment of electrophoretic mobility block and the experimental results of DNA enzyme I have shown that CRP has a direct binding on the gene cyaA. The determination of the concentration of intracellular cyclized adenosine phosphate (cAMP) further confirmed the negative regulation of the CRP to the gene cyaA. The results showed that the two virulence regulation factors, Hfq and CRP in Yersinia pestis, were regulated by the respective virulence regulation pathway _ biofilm formation and the regulation of the adenoid acid cyclase, respectively. The results showed that the existence of plasmid pCD1 has a great effect on the process of the regulation of the biological membrane of Hfq. In the presence of the plasmid, the Hfq is under the regulation of the biological membrane, and the Hfq is positive in the case of the deletion of the plasmid. The membrane is negative regulation. hmshfrs and hmsT are regulated by the post-transcriptional mode, hmsP is regulated by transcription and post-transcriptional regulation, and the formation of biofilms is co-regulated. hmsD is not involved in the regulation of hfq under the experimental conditions. The CRP has no regulation on its own gene and does not act on its base. As a result of the promoter region. Inhibition of its transcription. CRP inhibits the production of cAMP by acting on the adeno-acid cyclase gene, which represents the negative feedback self-regulation of CRP in the Yersinia pestis.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R516.8

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本文編號：2480461