【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)是嚴(yán)重威脅人類健康的病原微生物之一。人類感染丙型肝炎病毒后,常發(fā)展為慢性感染及肝硬化、肝細(xì)胞癌等嚴(yán)重肝病,對人類的生活質(zhì)量構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前干擾素(Interferon, IFN)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin, RBV)是治療HCV感染的標(biāo)準(zhǔn)療法。而這種療法并不是對所有患者有效,并且常引起嚴(yán)重的副作用。2009年,多項(xiàng)研究表明IL-28B,作為Ⅲ型干擾素家族成員之一,其個體基因多態(tài)性與HCV感染的干擾素治療效果密切相關(guān),期望可以將IL-28B的遺傳變異作為預(yù)測干擾素治療結(jié)果的重要生物標(biāo)記物。 miRNA是長度在22個核苷酸左右的非編碼RNA,是基因轉(zhuǎn)錄后負(fù)向調(diào)控因子。干擾素是哺乳動物抗病毒免疫的關(guān)鍵成分。ISG被認(rèn)為是干擾素發(fā)揮抗病毒功能的主要效應(yīng)因子,對干擾素抗病毒機(jī)制的研究也多集中于ISG,鮮有關(guān)于Ⅰ型和Ⅲ型干擾素調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)的研究,對miRNA參與干擾素抗病毒的研究也較少見。因此,本論文主要對Ⅰ型和Ⅲ型干擾素所調(diào)節(jié)的：miRNA表達(dá)譜進(jìn)行研究,揭示兩種干擾素調(diào)控miRNA表達(dá)的異同,并且闡述干擾素調(diào)節(jié)的miRNA抗HCV的功能和機(jī)制,為HCV感染新療法的研發(fā)提供新的靶點(diǎn)。 本研究首先對酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)得到的人源IL-28B重組蛋白(recombinant human IL-28B, rhIL-28B)進(jìn)行了抗病毒、信號通路激活、受體分布等特性的鑒定。rhIL-28B可以有效抑制HCVcc (cell culture derived-HCV)在肝癌細(xì)胞Huh7.5.1中的增殖,并能與利巴韋林協(xié)同抗病毒。IL-28B通過與受體IL-10R2和IL-28R1結(jié)合,有效激活JAK-STAT信號通路,誘導(dǎo)磷酸化STAT1和ISG (IFN-stimulated genes)的表達(dá)。而特異性識別受體IL-10R2和IL-28R1的抗體能夠抑制IL-28B的抗病毒效果。通過檢測不同細(xì)胞類型中干擾素激活I(lǐng)SG的情況,我們發(fā)現(xiàn)IL-28B只特異性識別肝、肺、前列腺、結(jié)腸癌等細(xì)胞類型,而IFN-α對多種細(xì)胞類型具有廣譜嗜性。因此,有效的抗HCV活性和有限的細(xì)胞類型嗜性等特點(diǎn),使IL-28B有可能成為治療HCV感染的有效候選因子。 為了揭示Ⅰ型和Ⅲ型干擾素調(diào)節(jié)的miRNA表達(dá)譜是否相同,本研究利用熒光實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測了IFN-α和IL-28B處理對肝細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響,并且重點(diǎn)分析了兩種干擾素誘導(dǎo)miRNA表達(dá)的異同。我們發(fā)現(xiàn)160個]miRNA的表達(dá)水平發(fā)生了變化,其中既有Ⅰ型和Ⅲ型干擾素共同調(diào)節(jié)的miRNA,也有差異調(diào)節(jié)的miRNA。這種差異即體現(xiàn)在miRNA變化的程度上,還體現(xiàn)在miRNA表達(dá)變化的方向上。我們對這些miRNA的抗病毒活性進(jìn)行了篩選,發(fā)現(xiàn)let-7b可以顯著抑制HCV感染,并且存在劑量和時間梯度依賴性。突變let-7b5'端的6-8bp的種子序列,會影響let-7b的抗病毒活性。let-7b與其他已知的HCV抑制藥物聯(lián)合使用能增強(qiáng)let-7b的抗病毒功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)let-7b主要通過抑制HCV蛋白翻譯和復(fù)制來抑制病毒增殖。 miRNA可能通過打靶病毒基因組抑制病毒感染,也可能通過打靶宿主基因影響病毒的生活周期。通過機(jī)制分析我們發(fā)現(xiàn)let-7b可以直接與HCV基因組相互作用抑制病毒復(fù)制。此外,IGF2BP1(insulin-like growth factor2mRN A-binding protein1)是HCV復(fù)制的正向調(diào)控因子。let-7b能夠識別IGF2BP1的mRNA序列,并降低其表達(dá)水平,進(jìn)而影響HCV的感染。let-7家族成員具有相同的種子序列,均可以抑制IGF2BP1的表達(dá)和HCV復(fù)制。需特別指出的是,降低let-7b的表達(dá)水平可有效減弱IFN-a和IL-28B的抗HCV效果。由此我們推測let-7b參與Ⅰ型和Ⅲ型干擾素的抗病毒過程。 綜上所述,我們通過檢測IL-28B的抗病毒效果、信號通路激活和細(xì)胞種類親嗜性,發(fā)現(xiàn)IL-28B具有有效的抗HCV活性和有限的細(xì)胞類型親嗜性,進(jìn)一步確定了IL-28B作為新的抗HCV藥物的潛在特質(zhì)。通過對Ⅰ型和Ⅲ型干擾素調(diào)節(jié)的肝細(xì)胞miRNA表達(dá)譜進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)既有Ⅰ型和Ⅲ型干擾素共同調(diào)節(jié)的1niRNA,也有兩種干擾素差異調(diào)節(jié)的miRNA.對干擾素調(diào)節(jié)的miRNA進(jìn)行抗病毒活性檢測,發(fā)現(xiàn)let-7b可以顯著抑制HCV復(fù)制和翻譯。重要的是我們發(fā)現(xiàn)let-7b受Ⅰ型和Ⅲ型干擾素調(diào)節(jié),參與到干擾素的抗病毒功能中。let-7b即可以直接與HCV基因組相互作用抑制病毒復(fù)制,也能夠通過降低宿主因子IGF2BP1表達(dá)水平,間接影響HCV的感染。這些研究結(jié)果進(jìn)一步提示miRNA和Ⅲ型干擾素在宿主抗病毒免疫應(yīng)答方面的重要性,為研發(fā)治療HCV感染的新療法的提供了新的靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R512.63;R3411

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本文編號：2460002