【摘要】：根據(jù)世界衛(wèi)生組織2010年的數(shù)據(jù)，全球大約有1.7億人感染了丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）。感染HCV后，約有75-85%的患者進展為慢性肝炎。其中至少20%的感染者在未來20年內(nèi)發(fā)展為肝硬化或肝癌[1]。在歐洲和南美洲，20-30%的肝移植患者是因感染HCV感所致[2]。目前尚無有效的HCV疫苗，注射干擾素加口服利巴韋林等治療措施的有效性也只有50%左右，且會出現(xiàn)各種副作用，更重要的是我們尚未明確HCV的逃逸致病機制[3]。因此，我們必須盡可能的將其研究清楚，以便我們制定出更加有效的治療方案。 趨化因子是一類小分子分泌性蛋白質(zhì)，可吸引中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞移動到炎癥部位，增強炎性細(xì)胞的吞噬殺傷功能，參與免疫調(diào)節(jié)和病理損傷。趨化因子C-X-C配體（chemokine C-X-C ligand, CXCL）屬α趨化因子，其結(jié)構(gòu)中含有保守的半胱-X-半胱（C-X-C）基序，主要激發(fā)中性粒細(xì)胞趨化性。其中，CXCL9又稱為“γ干擾素誘導(dǎo)的單核細(xì)胞因子（monokine induced by gamma interferon,MIG）”，是T細(xì)胞趨化因子；CXCL11又稱為“干擾素誘導(dǎo)的T細(xì)胞α趨化因子（Interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant, I-TAC）”，結(jié)合CXCR3，對活化的T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞發(fā)揮趨化作用。研究發(fā)現(xiàn)HCV患者血清中趨化因子CXCL9、CXCL11水平升高，可與T細(xì)胞上受體CXCR3結(jié)合后，有助于將T細(xì)胞募集至HCV病毒感染部位，發(fā)揮細(xì)胞免疫應(yīng)答，有助于清除HCV病毒；且有研究證實，慢性肝炎患者CD4+T和CD8+T細(xì)胞高表達(dá)組織歸巢受體（CD161），與趨化因子受體水平呈正相關(guān)，也進一步證實T細(xì)胞被趨化因子募集至肝臟。然而仍有75-85%HCV感染者發(fā)生慢性化，提示募集至肝臟中的T細(xì)胞沒有發(fā)揮有效的免疫應(yīng)答，將HCV病毒清除；一系列研究證實HCV感染者T細(xì)胞處于失能狀態(tài)，導(dǎo)致T細(xì)胞失能的因素有多種，近期大量研究發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶Cbl-b是近年發(fā)現(xiàn)的首個直接參與T細(xì)胞活化和耐受的E3泛素連接酶。在很多感染性疾病中Cbl-b都發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，而目前尚未見有關(guān)Cbl-b在慢性丙型肝炎中的相關(guān)報道。因此，本實驗擬通過探索Cbl-b在T細(xì)胞失能中的作用及規(guī)律，進一步闡明HCV感染時T細(xì)胞失能的機制，為抗HCV治療提供新的思路和方法。 1．血清趨化因子CXCL9和CXCL11的檢測 采取健康人和丙肝患者全血,2h內(nèi)進行處理，吸取上層血清標(biāo)本凍存于-80℃超低溫冰箱中備用。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清CXCL9和CXCL11。 2．外周血Cbl-b、CD28和CTLA-4的表達(dá)的檢測 采取健康者和患者的外周血，分離出外周血單個核細(xì)胞（PBMC），將細(xì)胞調(diào)至5×106個／mL，參照美國Invitrogen公司的Trizol試劑說明提取總的RNA并定量。用1gRNA反轉(zhuǎn)錄，再加入引物用PCR試劑盒擴增目的基因。 3．Cbl-b腺病毒載體的構(gòu)建和包裝 將Cbl-b基因定向插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒pAV.EX1d-CMV中，獲得重組質(zhì)粒pAV.Ex1d-CMVCBL-B/IRES/EGFP，再轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,包裝腺病毒表達(dá)載體。用不同方法檢測腺病毒載體。通過酶切、PCR及測序?qū)Υ┧筚|(zhì)粒進行了鑒定。 結(jié)果： 1．健康對照組血清CXCL9、CXCL11的濃度低于慢性丙型肝炎組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。在慢性丙型肝炎組內(nèi)，CXCL9和CXCL11的水平在不同HCV1b基因型組和2a基因型組之間無顯著差異。CXCL9和CXCL11濃度與血清ALT水平無相關(guān)性，與HCV RNA載量也無相關(guān)性。 2．Cbl-b、CD28和CTLA-4mRNA在慢性丙型肝炎患者中較健康對照組表達(dá)升高，其中CTLA-4的升高表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)意義；在HCV lb基因型中，Cbl-b和CTLA-4mRNA水平較HCV2a基因型顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而這三個分子與HCVRNA和ALT水平均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。 3．經(jīng)酶切及PCR鑒定，Cbl-b腺病毒載體構(gòu)建成功，進一步研究Clb-b在HCV感染中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。 綜上所述，，Cbl-b在丙型肝炎患者T細(xì)胞失能中可能起到了負(fù)性調(diào)節(jié)作用，具體機制仍需進一步的研究和探索。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R512.63

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 趙永平,白文俊,閆征,陳國強,劉士軍,鄧慶平,王曉峰;人磷酸二脂酶基因反義RNA重組腺病毒載體的構(gòu)建[J];中華男科學(xué)雜志;2005年05期

2 劉斌;匡安仁;;MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通道的基因變異與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展及診治[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2012年06期

本文編號：2455258