【摘要】：研究背景樹(shù)突狀細(xì)胞自然殺傷細(xì)胞凝集素家族受體1(DC NK lectin group receptor-1,DNGR-1)又稱(chēng)為C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族9成員A(C-type lectin domain family 9 member A,CLEC9A),屬于II型跨膜蛋白,為C-型凝集素受體家族成員之一。DNGR-1的表達(dá)具有高度的DC選擇性,其配體是死亡和受損細(xì)胞暴露的纖維狀肌動(dòng)蛋白(Filament actin,F-actin)。DNGR-1參與DC的內(nèi)吞功能,與交叉呈遞死亡細(xì)胞和腫瘤相關(guān)抗原、啟動(dòng)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答有關(guān),在腫瘤疾病的預(yù)防和治療,以及抗病毒感染中具有重要的作用。目前,DNGR-1的研究主要集中在人和小鼠DNGR-1結(jié)構(gòu)、功能以及在誘導(dǎo)腫瘤和病毒特異免疫應(yīng)答中的作用等方面。人DNGR-1分子主要表達(dá)在BDCA3+(CD141+)DC表面,小鼠DNGR-1主要表達(dá)在CD8α+DC表面,都與DC抗原交叉呈遞功能有關(guān)。但人與小鼠的DNGR-1在胞質(zhì)區(qū)的ITAM樣結(jié)構(gòu)、剪切異構(gòu)體數(shù)目以及是否以二聚體或單體形式表達(dá)等方面不同,而且人DNGR-1和小鼠Dngr-1基因的核苷酸和氨基酸序列的相似性較低。恒河猴與人類(lèi)親緣關(guān)系較近,是疫苗和人類(lèi)疾病研究的重要?jiǎng)游锬Ｐ�。為更好地利用恒河猴研究DNGR-1在艾滋病病理過(guò)程中的作用及其在艾滋病疫苗創(chuàng)制中的應(yīng)用前景,本研究克隆表達(dá)了恒河猴DNGR-1基因,闡述了其分子特性、細(xì)胞和組織分布以及HIV/SIV感染對(duì)不同組織中DNGR-1表達(dá)的影響。為深入研究DNGR-1的相關(guān)人類(lèi)疾病及探索艾滋病靶向治療方法提供必要的科學(xué)基礎(chǔ)。研究方法1、建立RT-PCR和RACE方法擴(kuò)增恒河猴DNGR-1cDNA全長(zhǎng)序列,用Bioedit(ClustalW)和MegAlign(ClustalW)軟件對(duì)編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),并用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。2、構(gòu)建恒河猴DNGR-1分子胞外端C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(C-type lectin-like domain,CTLD)的原核表達(dá)質(zhì)粒,在BL21(DE3)大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白,純化、復(fù)性后免疫新西蘭大白兔制備抗恒河猴DNGR-1抗體。同時(shí)構(gòu)建恒河猴DNGR-1真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞用于體外粘附實(shí)驗(yàn)。3、采用去除血清、自然凋亡和多聚甲醛固定并透化等方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞膜損傷,PMA和LPS刺激THP-1細(xì)胞焦亡,流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光方法進(jìn)行配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。4、利用巢氏PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)組織中DNGR-1mRNA的表達(dá)水平;利用Western Blotting檢測(cè)組織中DNGR-1蛋白水平;采用TSA信號(hào)放大系統(tǒng)進(jìn)行免疫熒光染色,激光掃描共聚焦顯微鏡觀察組織中DNGR-1+細(xì)胞的分布。5、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SHIV/SIV感染的恒河猴血液(感染后不同時(shí)間點(diǎn))、腸道、淋巴結(jié)等組織和HIV感染者血液中的DNGR-1mRNA水平。同時(shí)采集HIV/SIV感染后的血液進(jìn)行DNGR-1配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果1、獲得了長(zhǎng)度為1270bp的恒河猴DNGR-1cDNA核苷酸序列。DNGR-1編碼區(qū)、5'非編碼區(qū)(5'-untranslated region,UTR)和 3'-UTR序列分別為 726bp,124bp 和 420bp。該基因位于第11號(hào)染色體,對(duì)應(yīng)在中國(guó)恒河猴基因組中的序列為15739bp,編碼區(qū)包含6個(gè)外顯子。推測(cè)的DNGR-1分子包括胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)、頸部區(qū)和CTLD。恒河猴DNGR-1基因編碼區(qū)核苷酸和推測(cè)的氨基酸序列與GenBank中已有序列(截至2015年)的相似性分別為71.3%-99.3%和54.4%-99.2%,與靈長(zhǎng)目動(dòng)物的相似性最高,與嚙齒類(lèi)動(dòng)物的相似性最低。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中,恒河猴DNGR-1與猴科的關(guān)系最近,位于同一分支;與人科的關(guān)系比較近;與嚙齒類(lèi)等動(dòng)物的關(guān)系比較遠(yuǎn),位于不同的分支。2、成功表達(dá)了恒河猴DNGR-1的CTLD區(qū),獲得了重組DNGR-1CTLD蛋白。恒河猴DNGR-1 CTLD與人的抗原性相似,基于該蛋白制備的抗恒河猴DNGR-1抗體可以用于組織中DNGR-1+細(xì)胞的檢測(cè)。重組CTLD蛋白具有生物學(xué)活性,能夠識(shí)別原代細(xì)胞(血液及PBMC)和傳代細(xì)胞系細(xì)胞(HeLa和293T等)中的凋亡和死亡細(xì)胞。此外,重組CTLD蛋白還可以結(jié)合焦亡的THP-1細(xì)胞。HeLa細(xì)胞表面表達(dá)重組恒河猴DNGR-1蛋白后可以粘附凋亡的MT-4和恒河猴PBMC。3、發(fā)現(xiàn)DNGR-1基因在恒河猴大部分組織中均有表達(dá)。淋巴結(jié)、脾臟和血液中的表達(dá)水平較高;胃腸道、肺臟、扁桃體等組織的表達(dá)水平較低;皮膚、肌肉、腦(大腦、小腦和脊髓)和心血管系統(tǒng)(心臟、動(dòng)脈)、氣管和骨髓中的表達(dá)水平最低。觀察到表達(dá)DNGR-1(DNGR-1+)的細(xì)胞,它們存在于空回腸中段和結(jié)腸近端的固有層,腹股溝淋巴結(jié)的皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)的交界處,脾臟組織的白髓邊界、紅白髓交界及邊緣區(qū)(數(shù)量極少),尚未在胸腺和胃底組織中觀察到DNGR-1+細(xì)胞。4、觀察了DNGR-1mRN 水平在免疫缺陷病毒感染后的變化。恒河猴感染SHIV/SIV后,血液中DNGR-1mRNA水平隨感染時(shí)間的變化而變化。第一次(SHIV-sf162p4直腸)攻毒后的第41d(P=0.0317)、第二次(SHIV-sf162p4靜脈)攻毒后的第4d(P=0.0159)、第11d(P=0.0079)、第98d(P=0.0205)和第三次(SIVmac251靜脈)攻毒后第4d(P=0.0483)、第 11d(P=0.0317)、第 182d(P=0.0125),血液中 DNGR-1mRNA 水平均較攻毒前顯著降低(Mann-Whitneytest),感染后75周的轉(zhuǎn)錄水平與正常動(dòng)物水平相近。整個(gè)感染過(guò)程中,第二次和第三次攻毒后的前期(約11d),血液中DNGR-1mRNA水平最低,隨后逐漸升高至正常動(dòng)物水平后又降低,第三次感染后期(實(shí)驗(yàn)終止前)再次升高至正常動(dòng)物水平。感染后75周,腸道、淋巴結(jié)、PBMC和血液中的DNGR-1轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)升高趨勢(shì),其中結(jié)腸近端、腸系膜淋巴結(jié)和PBMC中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于正常動(dòng)物(P=0.0079,P=0.0317和P=0.0159)。人感染HIV(約3年)后,血液中DNGR-1mRNA水平較正常人明顯降低,而且抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(Antiretroviral Therapy,ART)后DNGR-1mRNA水平顯著降低(P0.0001),與病毒耐藥與否無(wú)關(guān)。某些HIV感染者血液中DNGR-1mRNA水平可能與病毒載量和CD4+T細(xì)胞數(shù)量具有負(fù)相關(guān)性。5、觀察了免疫缺陷病毒感染血液中DNGR-1識(shí)別細(xì)胞的變化。重組CTLD蛋白可以識(shí)別SIV/HIV感染血液中的凋亡和死亡細(xì)胞。恒河猴感染SIV后,重組CTLD蛋白結(jié)合細(xì)胞水平降低,而經(jīng)過(guò)ART的HIV感染者的DNGR-1識(shí)別細(xì)胞水平升高,識(shí)別凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)和能力取決于血液中發(fā)生凋亡細(xì)胞的比例和病毒感染后血液中處于不同時(shí)期的凋亡細(xì)胞水平。結(jié)論本研究首次獲得了恒河猴DNGR-1cDNA的核苷酸序列,發(fā)現(xiàn)與人的DNGR-1基因和結(jié)構(gòu)高度相似,能夠編碼與人抗原性相似的蛋白質(zhì)。恒河猴DNGR-1基因在大部分組織中均有表達(dá),不同組織中的DNGR-1mRNA水平不同,腸道(空回腸中段和結(jié)腸近端)和淋巴結(jié)(腹股溝淋巴結(jié))組織中存在表達(dá)DNGR-1的細(xì)胞。重組恒河猴DNGR-1胞外區(qū)CTLD蛋白具有生物活性,能夠結(jié)合不同類(lèi)型的凋亡和焦亡細(xì)胞。免疫缺陷病毒感染能夠影響DNGR-1基因的轉(zhuǎn)錄水平。重組CTLD蛋白能夠結(jié)合SIV/HIV感染血液中的凋亡細(xì)胞,DNGR-1識(shí)別細(xì)胞水平在SIV感染個(gè)體血液中降低,在經(jīng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的HIV感染者的血液中升高,識(shí)別凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)和能力與凋亡細(xì)胞的比例及處于不同時(shí)期的凋亡細(xì)胞水平有關(guān)。本研究表明恒河猴DNGR-1與人的高度相似,恒河猴作為動(dòng)物模型的研究成果更易于向AIDS和腫瘤等疾病的預(yù)防、治療和臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化,免疫缺陷病毒感染對(duì)DNGR-1基因的表達(dá)具有顯著影響,抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療未能使其恢復(fù)至正常水平,需要在AIDS治療疫苗研究中得到重視。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R512.91
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本文編號(hào)：2446933