【摘要】：乙型病毒性肝炎是一個全球性的健康問題,在全世界有超過3.5億乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染者。迄今在乙型病毒性肝炎防治領(lǐng)域仍存在許多重大的、尚待解決的科學問題,如對HBV生活周期和復制過程的了解仍有限;HBV侵襲肝細胞的分子機制;慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化和肝癌的發(fā)病機制仍未完全闡明。HBV感染與復制模型是研究HBV生物學特性、探索抗HBV藥物的新靶點、抗HBV藥物耐藥性的研究以及篩選新的抗病毒藥物、評價新的免疫療法和疫苗必不可少的重要工具。許多病毒通過插入外源基因,構(gòu)建了復制型病毒載體,并且在分子生物學研究中發(fā)揮了重要的作用。如果把HBV改造為可示蹤的復制型病毒載體,將可以大大提高新型抗HBV藥物的研發(fā)效率,并有助于闡明HBV研究領(lǐng)域中許多尚待解決的科學問題。鑒于上述挑戰(zhàn),本課題利用本實驗室前期構(gòu)建的復制型HBV載體,結(jié)合熒光分子及熒光素酶報告基因最新進展,構(gòu)建分別表達小分子熒光基團(miniSOG)、標準型Nanoluc~(TM)熒光素酶(Nanoluc Luciferase,Nluc)和分泌型Nanoluc~(TM)熒光素酶(Secretory Nanoluc Luciferase Sec Nluc)三種報告基因的復制型HBV載體,檢測重組HBV生物學特性及其,感染能力。目的:利用miniSOG、Nluc、secNluc的報告特性,形成可示蹤的,復制型重組HBV載體并檢測其生物學特性及其感染能力。方法:1 PCR方法獲得miniSOG、Nluc、secNluc全長序列。2利用基因重組技術(shù),將所獲得的miniSOG、Nluc、secNluc序列,亞克隆至本實驗室先前構(gòu)建的復制型載體pCH-rep中,構(gòu)建如下3個質(zhì)粒:pCH-miniSOG、pCH-Nluc、pCH-secNluc。以我實驗室先前構(gòu)建的帶有四環(huán)素調(diào)控元件和潮霉素抗性基因的野生型pTRE-HBV-C7-5為母體質(zhì)粒,將HBV部分替換為上述表達報告基因的HBV-miniSOG、HBV-secNluc,獲得pTRE-HBV-miniSOG、pTRE-HBV-secNluc載體。3 pCH-miniSOG分別瞬時轉(zhuǎn)染HepG2、293、Huh7細胞系,以本實驗室先前構(gòu)建的HBV復制型載體pCH-hr GFP為對照,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后72小時細胞內(nèi)熒光強度。4質(zhì)粒pCH-3093、pCH-Nluc、pCH-secNluc、pCH-miniSOG及攜帶殺稻瘟菌素抗性基因(Blasticidin Regene,Bsd R)和人源綠色熒光蛋白(Humanized Green Fluorescent Protein,hr GFP)的載體pCH-Bsd R、pCH-hr GFP分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞,轉(zhuǎn)染后72小時,提取細胞總核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA),Northern blot檢測HBV RNA的表達。5將上述6種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞,轉(zhuǎn)染后72h提取細胞內(nèi)總蛋白,使用9H9和4/7B表面抗原(HBs Ag)的混合抗體,Western blot檢測HBV囊膜蛋白的表達(Pre S1、Pre S2、S)。使用mc-312抗體,Native western blot檢測核心蛋白表達情況。6將上述6種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞,化學發(fā)光法分別定量檢測細胞培養(yǎng)上清液中乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBs Ag)與乙型肝炎e抗原(patitis B e-antigen,HBe Ag)表達。7將上述6種質(zhì)粒及pTRE-3093、pTRE-HBV-miniSOG、pTRE-HBV-secNluc、PTRE-HBV-hr GFP分別瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細胞,提取脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),Southern blot檢測重組體復制中間體的表達。8將上述6種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞,轉(zhuǎn)染后72小時提取細胞上清液,細胞培養(yǎng)上清液用內(nèi)切酶Dpn I、DNase I及核酸酶預處理,實時熒光定量PCR檢測乙型肝炎病毒載量(Hepatitis B virus deoxyribonucleic acid,HBV-DNA)。9 pCH-Nluc、pCH-secNluc分別瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細胞系。使用promega的Nano-Glo?Luciferase檢測試劑在轉(zhuǎn)染后不同時間點(24h、48h、72h、96h、120h)監(jiān)測細胞內(nèi)Nluc及細胞培養(yǎng)液中secNluc活性。10將pCH-secNluc載體瞬時轉(zhuǎn)染hepG2細胞,收集病毒顆粒,感染Hepa RG細胞系,感染后不同時間(第0天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天)測定細胞培養(yǎng)上清液中熒光素酶活性,評價其感染能力。結(jié)果:1聚合酶連反應(yīng)(ploymerase chain reaction,PCR)成功擴增出了miniSOG、Nluc、secNluc三個片段。并插入復制型HBV載體構(gòu)建了如下質(zhì)粒:pCH-miniSOG、pCH-Nluc、pCH-secNluc、pTRE-HBV-miniSOG、pTRE-HBV-secNluc,大小、酶切以及測序鑒定,與理論序列相同。2表達綠色熒光蛋白的復制型HBV載體熒光強度觀察:轉(zhuǎn)染后72h,熒光顯微鏡下觀察,miniSOG與hrGFP在Hepa G2、Huh7、293三種細胞系內(nèi)均見有熒光表達,miniSOG熒光強度要弱于hr GFP。3復制型HBV載體HBV RNA的表達:上述(方法-4)轉(zhuǎn)染的復制型HBV載體均可見轉(zhuǎn)錄出HBV前基因組RNA(pregenomic RNA,pg RNA)和亞基因組RNA(Subgenomic RNA,sgRNA)。與野生型HBV比較,pg RNA大小均較大。4復制型HBV載體囊膜蛋白的表達:上述(方法-4)轉(zhuǎn)染的復制型HBV載體均檢測到與野生型HBV相似的大、中、小蛋白。5復制型HBV載體核心蛋白的表達:上述(方法-4)轉(zhuǎn)染的復制型HBV載體均檢測到HBV核心蛋白的表達,與野生型HBV相似。6復制型HBV載體Hbs Ag與HBe Ag的表達:上述(方法-4)轉(zhuǎn)染的復制型HBV載體與野生型HBV載體比較,HBs Ag與HBe Ag在細胞培養(yǎng)上清中的定量水平相似,無統(tǒng)計學差異(P0.05)。7 Southern blot檢測分析復制型HBV載體在細胞外和細胞質(zhì)內(nèi)HBV DNA表達情況:與野生型HBV比較,攜帶Bsd R(399bp)、miniSOG(312bp)的復制型HBV載體無論是在細胞外還是在細胞質(zhì)內(nèi)復制水平下降不明顯,而攜帶Nluc(513bp)、secNluc(597bp)、hr GFP(720bp)載體HBV復制能力較弱。8復制型HBV載體分泌HBV DNA的檢測:與野生型HBV比較,上述(方法-4)轉(zhuǎn)染的各重組復制型HBV載體在細胞培養(yǎng)液中HBV-DNA,分泌水平有所下降(P0.05),但仍能達到10~6 copies/m L以上。9熒光素酶分析:pCH-Nluc,pCH-secNluc轉(zhuǎn)染Hepa G2細胞,于24h、48h、72h、96h、120h分別監(jiān)測細胞內(nèi)及細胞培養(yǎng)液中熒光素酶表達活性,在不同時間點,熒光素酶的信號強度不同。在24h、48h、72h逐漸上升,在72h時Nluc發(fā)光值可高達4.5ⅹ10~9以上,secNluc發(fā)光值可達2ⅹ10~9以上,96h開始有下降趨勢,但仍處于較高水平。10 HepRG細胞感染實驗:表達secNluc的病毒感染HepRG細胞后,分別在第0、2、4、6、8、10天監(jiān)測熒光素酶活性,于第6天熒光素酶活性最高,可達10~6水平,第8天仍保持此水平,第10天開始下降。結(jié)論:成功構(gòu)建了帶有報告基因的重組HBV載體:pCH-miniSOG、pCH-Nluc、pCH-secNluc、pTRE-HBV-miniSOG、pTRE-HBV-secNLuc。通過對復制型HBV載體生物學特性檢測,證明了攜帶報告基因的復制型HBV載體具備一定的復制、表達能力,所形成的重組HBV具有感染性。通過可易觀察的熒光蛋白和靈敏的熒光素酶檢測,將有助于HBV分子生物學研究及抗HBV藥物篩選。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62

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本文編號：2422988