【摘要】：研究背景:手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是一種病毒性疾病,具有傳染性。以發(fā)熱、厭食、口腔黏膜多發(fā)性潰瘍,和主要分布于手足等部位的小皰疹、斑丘疹為特點。病人大多為5歲以下的嬰幼兒。自1997年開始,手足口病在亞太區(qū)域的流行日趨嚴重,2008年在安徽阜陽、新加坡,2009年在廣東,手足口病的暴發(fā)和流行造成了成千上萬的患兒,甚至導致了數百兒童的死亡。但遺憾的是手足口病的致病機制現今仍不明確,也沒有針對性的的疫苗和抗病毒藥物。腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)為小 RNA 病毒科(Picornaradae)、腸道病毒屬(Enterovirus)的成員之一,是已知的手足口病的主要病原體之一,對于中樞神經系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)有極高的感染性。1969年,EV71第一次從糞便標本中分離出來,在之后的幾十年里該病毒已經在全世界許多國家中導致了多場流行與暴發(fā),而且其預后差,病死率高,被視為脊髓灰質炎病毒(Poliovirus)被控制后的危害最大的嗜神經性腸道病毒。MicroRNA(miRNA)是一種內生的、高度保守的非編碼的單鏈RNA,長約20～24個堿基。研究證明miRNA不僅在各類原核、真核細胞中起到重要的轉錄后基因表達調節(jié)作用,還參與了 EV71與宿主之間復雜的相互作用。一方面,宿主細胞利用miRNA影響EV71自我復制,另一方面,EV71也可以利用miRNA影響細胞基因表達進而干擾細胞的正常功能。本研究嘗試以人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,huc-MSCs)作為 EV71 體外感染的細胞模型,通過基因芯片和生物信息學技術研究miRNA在EV71感染過程中的改變,并探討其潛在的作用機制。目的:本課題的目的是探討MSC細胞對EV71病毒的易感性及以其作為研究EV71致病機制的細胞模型的可行性;同時通過基因芯片和生物信息學技術研究EV71感染過程中相關的信號通路,及與此相關的miRNA。我們希望通過本研究,可以進一步闡明miRNA在EV71病毒誘導的手足口病的致病機制,并為EV71病毒的預防與治療提供借鑒價值。方法:一、MSC細胞的培養(yǎng)與鑒定1.Huc-MSC細胞的體外培養(yǎng)。2.通過流式細胞儀檢測MSC細胞的免疫表型。二、EV71病毒滴度測定與細胞毒性實驗1.采用Reed-Muench兩氏法計算EV71的TCID50和病毒滴度。2.采用CCK-8試劑盒檢測以不同MOI的EV71進行感染的MSC的細胞存活率。三、基因芯片檢測1.采用TRNzol法提取總RNA,mirVanaTM miRNA Isolation Kit純化總RNA。2.采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。3.利用基因芯片技術檢測EV71病毒感染后相關mRNA、miRNA的變化。四、生物信息學分析與qRT-PCR1.利用Agilent GeneSpring軟件分析基因芯片的熒光雜交圖。2.利用qRT-PCR技術驗證miR-6068、miR-575、miR-134-5p、miR-582-5p的表達變化3.利用TargetScan、miRanda、PicTar和miRWalk四個生物信息學軟件對目的miRNA進行靶基因預測。4.利用DAVID基因注釋工具對異常表達的mRNA和目的miRNA的靶基因進行GO和KEGG分析。結果:1.經流式細胞儀檢測,發(fā)現MSC細胞表面抗原,CD34和CD45分別為0.42%和0.06%,呈陰性表達,而CD44和CD90分別為98.96%和100%,呈陽性表達。2.通過Reed-Muench兩氏法計算EV71毒株的半數組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture infective dose,TCID50),經計算該毒株 TCID50=10-87/0.1ml,病毒滴度為 3.5×108PFU/ml。3.CCK-8法檢測示:EV71對MSC有明顯的細胞毒作用,其細胞存活率隨著MOI的增高而降低。4.利用基因芯片技術共發(fā)現異常表達的miRNA共76條,mRNA共24條。5.qRT-PCR證實EV71感染后miR-6068和miR-575的表達量分別升高了 48倍和11倍,而miR-134-5p和miR-582-5p則分別降低了 16倍和15倍。6.通過GO分析,發(fā)現EV71病毒通過結合和催化的分子功能,干擾了代謝、信號轉導、生物過程調控、免疫系統(tǒng)等生物過程,進而影響了細胞、細胞部件、細胞器、細胞膜的功能;在KEGG分析中其主要涉及整合素β1、細胞外基質(ECM)受體、粘著斑、PI3K-Akt等通路。7.EV71病毒與整合素β1的相互作用可以通過miR-6068、miR-575、miR-134-5p、miR-582-5p進行調控。結論:MSC細胞對EV71病毒有易感性;EV71病毒通過調控整合素β1、細胞外基質(ECM)受體、粘著斑、PI3K-Akt等信號通路進而影響宿主細胞的正常功能;EV71病毒感染MSC后影響了其miRNA的正常表達,共發(fā)現76條異常表達的miRNA;EV71病毒與整合素β1的相互作用可以通過miR-6068、miR-575、miR-134-5p、miR-582-5p 進行調控。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R512.5

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本文編號：2378105