【摘要】：背景與目的 預(yù)防結(jié)核病的卡介苗(BCG)自發(fā)明以來在全球廣泛接種,能有效預(yù)防兒童重癥結(jié)核,但對成人肺結(jié)核保護性較差。BCG主要誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+Th1免疫應(yīng)答、且該應(yīng)答隨時間延長減弱,保護期僅10～15年；誘導(dǎo)CD8+T細胞應(yīng)答較弱,不能阻止體內(nèi)潛伏感染細菌的再次激活。因此,在卡介苗已有的保護性和安全性優(yōu)勢的基礎(chǔ)上,擬針對卡介苗的不足改造卡介苗,用于結(jié)核病的預(yù)防,具有重要意義和實踐價值。結(jié)合結(jié)核分枝桿菌在感染機體后存在的不同狀態(tài)且表達不同的抗原譜和機體抗感染的免疫保護機制,本研究擬將前期構(gòu)建的、分別過表達結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢抗原Ag85A、Ag85B和HspX的三株增強型重組卡介苗,即rBCG::85A、rBCG::85B和rBCG::X,按等比例混合,綜合利用其各自優(yōu)勢,制成“雞尾酒”重組卡介苗ABX。與親代卡介苗分別免疫小鼠,評價其抗結(jié)核分枝桿菌的短期保護效應(yīng)以及比較分析疫苗的免疫原性,為完成重組卡介苗ABX菌株的臨床前研究奠定基礎(chǔ)。 方法 1.評價重組卡介苗ABX抗M.tb急性感染保護性：將rBCG::85A、rBCG::85B和rBCG::X等比例配伍,制成重組卡介苗,命名為ABX,作為實驗組(1.02×106CFU/100μl/只)；親代BCG作為陽性對照組(1.5×106CFU/100μl/只),PBS免疫作為陰性對照組(100μl/只)。免疫C57BL/6小鼠8周后,尾靜脈注射M.tb H37Rv毒株(1.2×106CFU/只)攻擊感染。感染4周后,分別檢測小鼠肺臟和脾臟的細菌載量以及病理改變,觀察存活率。 2.評價重組卡介苗ABX的細胞免疫應(yīng)答：同上免疫C57BL/6小鼠,免疫后12周和32周后,收集脾細胞。 (1) ELISA檢測抗原Ag85A、Ag85B和HspX特異性的TNF-α、IFN-γ、IL-2及IL-4水平,以PPD刺激為陽性對照,RPMI1640為陰性對照。 (2)流式細胞儀(FCM)結(jié)合胞內(nèi)因子染色法(ICS)分析抗原特異性的CD4+T細胞中分泌TNF-α、IFN-γ+、IL-2+細胞總數(shù),進一步分析單陽、雙陽和三陽性多功能CD4+T細胞。以PPD刺激為陽性對照,RPMI1640為陰性對照。 (3) CFSE標(biāo)記法檢測體內(nèi)Ag85B特異的CD8+T細胞的CTL殺傷活性。 3.評價重組卡介苗ABX的免疫記憶水平：利用流式細胞術(shù),以CD62L、CD44表達作為分選標(biāo)志,分別檢測Ag85A、Ag85B和HspX抗原的CD4表位肽,Ag85B抗原CD8表位肽特異性的TCM (CD62Lhi CD44hi)、TEM (CD62Llo CD44hi)水平；同時結(jié)合胞內(nèi)細胞因子染色,進一步分析TEM細胞群中分泌IFN-y和TCM細胞群中分泌IL-2的細胞數(shù)。 4.評價重組卡介苗ABX的體液免疫應(yīng)答：ELISA檢測小鼠血清中Ag85A、Ag85B和HspX特異性的抗體總IgG及亞類IgG1、IgG2a的水平。 結(jié)果 1.重組卡介苗ABX增強抗M.tb急性感染的保護性：與親代BCG免疫小鼠相比,ABX組小鼠的肺臟荷菌量顯著降低(p=0.001),比BCG組減少0.585log；病理變化更輕微；肺臟切片偶見少量抗酸桿菌；短期存活率達100%。 2.重組卡介苗ABX誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的細胞免疫應(yīng)答： (1)免疫后12周和32周,與BCG組比較,ABX組產(chǎn)生較高水平的Ag85A、 Ag85B和HspX特異性TNF-α、IFN-γ。在免疫后12周,ABX組產(chǎn)生Ag85B、 HspX和PPD特異性IL-2水平高于BCG組(p0.05)。隨時間延長三種細胞因子分泌量增加�？乖禺愋缘腎L-4的濃度在各組間均低于30pg/mL,且無統(tǒng)計學(xué)差異。 (2)免疫后12周和32周,ABX疫苗組抗原特異性CD4+T細胞中分泌IFN-γ和TNF-α的細胞總數(shù)比BCG組顯著增加,IL-2細胞總數(shù)隨免疫時間延長,顯著升高。進一步分析多功能CD4+T細胞數(shù)量,ABX疫苗組誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的TNF-α+、IFN-γ+、IL-2+單陽細胞及TNF-α+-IFN-γ+雙陽細胞最為顯著,均不同程度高于BCG組(p0.05)。同時,Ag85A特異性的三陽,Ag85B特異性的IFN-γ+-IL-2+雙陽細胞也均顯著高于BCG組(p0.05)。 (3)免疫后12周和32周,ABX組靶向Ag85B的特異性殺傷率分別為28.8%和30.7%,分別顯著高于BCG組的9.64%和8.47%(p0.05)。 3.重組卡介苗ABX維持較高免疫記憶水平：Ag85A、Ag85B、HspX的CD4抗原肽刺激,ABX組在免疫后12周和32周特異性TCM、TEM細胞數(shù)均高于BCG組,并且以TEM細胞為主(p0.05)。Ag85B的CD8抗原肽刺激,ABX疫苗組以TCM細胞較多。分泌IL-2、IFN-γ的記憶細胞隨時間延長,細胞數(shù)增加。 4.重組卡介苗ABX誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的特異性抗體：與BCG免疫小鼠比較,ABX免疫小鼠32周產(chǎn)生較高水平Ag85A、Ag85B和HspX特異性抗體,尤其以IgG2a最顯著(p0.05),且明顯高于免疫后12周水平(p0.05)。ABX疫苗組IgG2a: IgG1比值大于1,隨時間延長,更趨向于Thl型免疫應(yīng)答。 結(jié)論 “雞尾酒”重組卡介苗ABX免疫對急性攻毒感染小鼠具有很強的免疫保護性,其保護性有賴于能誘導(dǎo)穩(wěn)定、持久的與過表達抗原相關(guān)的特異性CD4+Th1型細胞免疫應(yīng)答,主要產(chǎn)生以TNF-α+、IFN-γ+、IL-2+單陽細胞及TNF-a+-IFN-γ+雙陽為特征的CD4+多功能T細胞,并增強了CD8+T細胞的特異性殺傷活性,同時維持較高水平的免疫記憶細胞及特異性抗體水平。這些結(jié)果揭示,“雞尾酒”重組卡介苗ABX既繼承親代BCG對預(yù)防原發(fā)感染的優(yōu)勢,也顯著增強親代BCG的免疫原性、免疫記憶和免疫保護性,是具有良好應(yīng)用前景的候選疫苗。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R52

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Immune Responses and Protective Efficacy Induced by 85B Antigen and Early Secreted Antigenic Target-6 kDa Antigen Fusion Protein Secreted by Recombinant Bacille Calmette-Guérin[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2007年04期

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本文編號：2362395