【摘要】：近年來隨著生命科學(xué)的飛速發(fā)展及其與數(shù)學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)等多種學(xué)科的交叉與融合,逐漸產(chǎn)生了一門新的學(xué)科-定量生物學(xué)。自此,科學(xué)家的目光從定性的描述性研究逐漸向定量的整體化方向轉(zhuǎn)變,同時(shí)注重尋找生物系統(tǒng)的整體規(guī)律。定量生物學(xué)的發(fā)展對(duì)生命科學(xué)中的飛躍發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。 朊病毒病(Prion diseases)又稱為傳染性海綿狀腦病(TSE),是一類人畜共患的神經(jīng)退行性疾病。20世紀(jì)80年代歐洲爆發(fā)的“瘋牛病”以及由此產(chǎn)生的人新型克雅氏病(nv-CJD),引發(fā)了世界范圍的空前恐慌,給人類健康造成巨大的威脅。這類疾病具有相似的臨床癥狀和組織病理學(xué)改變,都是由一種具有自我復(fù)制能力的蛋白感染粒子-朊病毒引起的。目前人們普遍認(rèn)為朊病毒蛋白具有兩種構(gòu)象：細(xì)胞型朊蛋白(Cellular prion protein,PrPc)和致病型朊蛋白(scrapie of pathogenic isoform, Prp.sc)。朊病毒病的發(fā)生是由于PrPc發(fā)生錯(cuò)誤折疊產(chǎn)生PrPSc,同時(shí)prpSc可以誘導(dǎo)更多的’PrPc發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變,prpSc成指數(shù)型增加形成聚集體進(jìn)而引發(fā)病變。但是TSE在宿主內(nèi)的潛伏期很長,潛伏期內(nèi)患病動(dòng)物無明顯臨床癥狀,PrPsc含量極少；同時(shí),不同毒株中朊病毒理化性質(zhì)的差別非常大,導(dǎo)致TSEs的早期臨床診斷和治療都面臨著巨大的挑戰(zhàn)。本論文利用量子點(diǎn)(QDs)獨(dú)特的發(fā)光性質(zhì)及金銀納米顆粒的強(qiáng)等離子共振性質(zhì)通過建立能量轉(zhuǎn)移體系,從定量生物學(xué)的角度,將化學(xué)與生物學(xué)進(jìn)行有機(jī)融合,實(shí)現(xiàn)了對(duì)朊蛋白的簡單、快速、靈敏的定量檢測(cè),并根據(jù)朊蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)篩選出一種小分子多肽,對(duì)穩(wěn)定朊蛋白的構(gòu)象具有非常重要的作用。主要研究內(nèi)容如下： 1.基于朊蛋白-適配子相互作用實(shí)現(xiàn)朊病毒蛋白的靈敏檢測(cè)SERS用于雙核酸適配子與朊蛋白相互作用研究表面增強(qiáng)拉曼散射由于在分子水平上提供了比傳統(tǒng)拉曼散射更豐富的物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息,近年來得到了廣大科學(xué)工作者的親睞。有文獻(xiàn)報(bào)道朊蛋白有兩段DNA適配子,可以分別與其N末端23-90以及90-231兩個(gè)表位結(jié)合,對(duì)朊蛋白具有更好地選擇性。我們用考馬斯亮藍(lán)染料在對(duì)蛋白質(zhì)-PrPc進(jìn)行標(biāo)記的同時(shí)作為拉曼信號(hào)分子,用于PrPc-aptamer之間的相互作用研究。實(shí)驗(yàn)過程中,我們將朊蛋白的適配子功能化修飾在Ag@Si NPs表面,因此,當(dāng)PrPc與其適配子結(jié)合時(shí),體系中形成Ag@Si聚集體,可以大大增強(qiáng)R-250的拉曼信號(hào)。該方法證明我們選用的兩段朊蛋白適配子確實(shí)可以同時(shí)識(shí)別靶物的不同位點(diǎn),形成PrPc-aptamer復(fù)合物,并結(jié)合納米銀增強(qiáng)的R-250拉曼信號(hào)用于朊蛋白的檢測(cè)研究。對(duì)于進(jìn)一步發(fā)展基于雙核酸適配子策略的朊蛋白檢測(cè)方法具有非常重要的作用。 基于雙適配子的金屬增強(qiáng)熒光策略用于檢測(cè)朊蛋白我們合成了一種表面易于生物功能化的硅包銀納米顆粒,利用該納米銀與熒光染料之間的金屬增強(qiáng)熒光建立了可在溶液中進(jìn)行的簡單、快速的朊蛋白的分析方法。首先在硅包銀納米顆粒表面修飾抗朊蛋白核酸適配子(Apt1),另一段核酸適配子(Apt2)修飾Cy3染料。Apt1和Apt2可以同時(shí)識(shí)別PrPc的兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn),因此,當(dāng)PrPc存在時(shí)適配子發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變,分別與PrPc上相應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合,從而形成Ag@SiNPs-PrPc-Cy3三明治結(jié)構(gòu)。通過控制核殼型納米粒子硅殼的厚度調(diào)整該納米探針與染料分子之間的距離。由于納米銀的強(qiáng)等離子共振性質(zhì),當(dāng)納米探針與染料分子之間的距離足夠近時(shí)就會(huì)發(fā)生金屬增強(qiáng)熒光,Cy3熒光強(qiáng)度的增加與PrPc濃度呈很好的線性關(guān)系,可用于靈敏檢測(cè)PrPc。同時(shí)該方法也適用于復(fù)雜樣品如小鼠腦組.織勻漿中PrPc的檢測(cè),及細(xì)胞內(nèi)朊蛋白的實(shí)時(shí)成像分析。 長程共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)朊蛋白超靈敏檢測(cè)我們進(jìn)一步利用量子點(diǎn)和納米金分別作為能量的供體和受體,量子點(diǎn)-金納米粒子表面能量轉(zhuǎn)移發(fā)展了一種長距離能量轉(zhuǎn)移體系,實(shí)現(xiàn)了對(duì)朊蛋白的超靈敏檢測(cè)。當(dāng)體系中存在朊蛋白時(shí),Ni2+與朊蛋白組氨酸標(biāo)簽的相互作用使得NTA-Ni2+修飾量子點(diǎn)和核酸適配子修飾的金納米粒子因?yàn)榫嚯x拉近而發(fā)生表面能量轉(zhuǎn)移,量子點(diǎn)的熒光被金納米粒子猝滅,猝滅效率高達(dá)88.7%,能量轉(zhuǎn)移距離9-22nm,據(jù)此建立的朊蛋白檢測(cè)方法檢測(cè)限可達(dá)33aM。由于量子點(diǎn)以及金納米顆粒具有很好的生物穩(wěn)定性,該能量轉(zhuǎn)移體系不但可以用于復(fù)雜生物樣品中PrPc的靈敏檢測(cè)。同時(shí),該長距離能量轉(zhuǎn)移體系還可以用于標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性朊蛋白,實(shí)時(shí)追蹤其與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)相互作用及代謝反應(yīng)途徑,對(duì)于朊病毒病的致病機(jī)理及其臨床監(jiān)測(cè)都具有非常重要的作用。 2.多肽與朊蛋白相互作用研究 朊病毒病至今尚無有效的治療方法,目前其首選治療策略主要是穩(wěn)定朊病毒蛋白中α-螺旋構(gòu)象,抑制其向β-折疊的轉(zhuǎn)化。朊蛋白180位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岬?80I突變蛋白的突變位點(diǎn)與其181位的糖基化位點(diǎn)非常接近,其生物化學(xué)性質(zhì)對(duì)朊病毒病的影響非常重要。本文針對(duì)180I突變蛋白的182-190段序列設(shè)計(jì)了KNFTK、KTDVE、EMMKE和EVVKK等四種axyzβ型多肽。其中xyz由PrP序列中相關(guān)的疏水氨基酸組成,并嵌入堿性(α)和酸性(β)氨基酸之間,因此它可以通過靜電作用力與PrP中相應(yīng)的酸性和堿性氨基酸之間形成鹽橋。鹽橋的形成使得蛋白質(zhì)的相對(duì)長度變短,對(duì)蛋白水解酶的敏感性降低,從而起到穩(wěn)定α-螺旋的作用。研究發(fā)現(xiàn),EVVKK能穩(wěn)定朊病毒蛋白的構(gòu)象,同時(shí)誘導(dǎo)p-折疊向α-螺旋的轉(zhuǎn)變,因此這種多肽有望作為一種新的藥物,用于朊病毒病的臨床治療。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R512.99

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2353998