【摘要】：禽流感病毒(AIV)多次爆發(fā)流行,H9N2亞型AIV是我國及世界許多國家禽類中的流行主型,常共存且進化活躍,對公共衛(wèi)生的意義重大。目前,對我國境內(nèi)H9N2亞型AIV研究尚比較缺乏,非常有必要加強對該亞型AIV的分布、進化、致病性及傳播力等方面的研究�；诖�,本研究主要對A/Brambling/Beijing/16/2012(H9N2禽流感病毒)的感染性、致病性及傳播力進行研究,并建立一種同時對H5N1和H7N9亞型流感病毒進行快速檢測的新方法。本研究為禽流感病毒致病機理、進化規(guī)律的深入研究提供有參考價值的實驗數(shù)據(jù),同時為新發(fā)病例提供監(jiān)測及治療方案的理論預(yù)測,對于應(yīng)對未來可能出現(xiàn)的禽流感疫情具有非常重要的現(xiàn)實意義。第一部分H9N2亞型禽流感北京燕雀分離株的致病性及傳播力研究H9N2禽流感病毒一直在家禽群體中流行,偶爾傳播給人類。在對中國北方流感病毒的監(jiān)測中,我們首次從北京燕雀肺組織中分離到一株H9N2禽流感病毒,并且其內(nèi)部基因與感染人的H7N9病毒高度同源,該病毒命名為(A/Brambling/Beijing/16/2012),我們對其生物學(xué)特性進行了研究。首先,為了解病毒的進化地位,進行進化分析,顯示該病毒的進化地位屬于BJ/94-like(A/chicken/Beijing/1/1994)亞系,這表明H9N2 BJ/94-like亞系病毒可能是目前在中國北方流行的主要毒株。然后,為了解其體內(nèi)感染力和致病性,我們開展了動物感染和傳播研究,證實野生株病毒對雞和小鼠具有較低的致病性;雖然在雪貂的鼻拭子和咽拭子中可以檢測到高水平的病毒釋放,但該病毒還沒有獲得在雪貂間通過空氣傳播的能力。隨后,為研究該病毒的致病潛能,通過鼠肺傳代適應(yīng),該毒株對小鼠的致病性上升很快,隨著病毒在鼠肺中傳代,毒力不斷增加,并導(dǎo)致小鼠死亡。最后,為分析其致病原因,開展鼠肺適應(yīng)株體外細胞感染實驗,顯示該病毒經(jīng)過鼠肺適應(yīng)后增加了對人源肺細胞的感染性,而且可在小鼠群體間進行有效傳播。對P0,P12-1,P12-2,P12-3病毒進行了全基因組測序,發(fā)現(xiàn)在鼠肺傳代過程中,病毒基因組內(nèi)有3個位點的氨基酸發(fā)生了替換和病毒致病力密切相關(guān)。值得注意的是,在體外受體結(jié)合試驗中,病毒只與人源α-2,6唾液酸受體結(jié)合,而不與禽源α-2,3唾液酸受體結(jié)合,這表明H9N2流感病毒具有潛在的公共衛(wèi)生風(fēng)險。因此,應(yīng)加大在人群、家禽和野禽中H9N2禽流感病毒的監(jiān)測力度,為其預(yù)警、預(yù)報提供依據(jù)。第二部分液相芯片方法同時檢測流感病毒H5N1和H7N9亞型流感病毒存在混合感染情況,有文獻報道,一位患者同時感染了兩種甲型流感病毒株:H7N9和H3N2。我們前期的實驗過程中也發(fā)現(xiàn)家禽分離的病毒樣本其實是多亞型的混合物,而且環(huán)境中存在H5N1和H7N9共存的現(xiàn)象。這些情況都迫切要求對流感病毒各亞型做出早期、快速的實驗室診斷。目前針對流行性感冒病毒的檢測方法有多種,但尚未有一種方法能夠快速簡便的對流感病毒各種亞型進行區(qū)分。因此需要建立一種對流感病毒各種型別進行快速鑒定的新方法。本研究中我們基于液相芯片技術(shù)(Multiply Analyte Suspension Array,MASA),建立了一種對禽流感病毒H5N1和H7N9亞型進行快速檢測的新方法。從數(shù)據(jù)庫中下載所有A型流行性感冒病毒H5、N1、H7和N9片斷核酸序列,篩選出需要的完整的核酸序列,利用生物學(xué)軟件對序列進行比對分析,找出保守序列,根據(jù)保守序列設(shè)計引物和探針,最后將設(shè)計合成的各種探針與不同編號的微球進行偶聯(lián),并進行實驗過程和檢測條件的優(yōu)化,最終研制出了檢測試劑盒。在本研究中我們利用該試劑盒檢測禽流感病毒H5N1和H7N9亞型和其它常見亞型(H1N1、甲流H1N1、H5N2、BH3N2和H9N2)標本。檢測H5N1和H7N9標本可獲得較高的熒光強度,為陽性結(jié)果,而其它亞型標本檢測為陰性結(jié)果,具有較好的特異性。在靈敏度試驗中,對H5N1和H7N9亞型cDNA標本10倍系列稀釋后進行檢測,證明該方法的檢測下限為5個拷貝。在重復(fù)性試驗中,每個樣本檢測三次,證明該方法的重復(fù)性良好,檢測系統(tǒng)非常穩(wěn)定。本研究為開發(fā)出更為快速有效的檢測其它各種流感病毒亞型的方法,提供了一條更為廣闊的途徑。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R511.7

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