發(fā)布時(shí)間：2018-11-15 12:43

【摘要】：第一部分臨床白色念珠菌抗真菌藥物敏感性和MLST分型研究目的:監(jiān)測(cè)江西地區(qū)白色念珠菌對(duì)臨床常用抗真菌藥物敏感性,為臨床白色念珠菌感染的合理用藥提供流行病學(xué)依據(jù)。對(duì)白色念珠菌進(jìn)行MLST分型研究,分析其流行進(jìn)化關(guān)系,查找本地區(qū)臨床白色念珠菌優(yōu)勢(shì)菌株。方法:1.分離和純化臨床菌株,利用CHROMagar顯色培養(yǎng)和多重PCR快速鑒定法鑒定白色念珠菌;2.按照美國(guó)臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的《酵母微量稀釋抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)參考方法第三版》(M27-A3)檢測(cè)白色念珠菌對(duì)兩性霉素B(Amphotericin B,AMP B)、5-氟胞嘧啶(5-Flucytosine,5-FC)、氟康唑(Fluconazole,FCZ)、伊曲康唑(Itraconazole,ICZ)和酮康唑(Ketoconazole,KETO)等5種臨床常見抗真菌藥物的敏感性;3.利用基于DNA測(cè)序的多位點(diǎn)序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)方法對(duì)白色念珠菌進(jìn)行基因分型;4.使用MEGA6.0對(duì)MLST分型中出現(xiàn)的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotide polymorphism,SNP)進(jìn)行分析,采用非加權(quán)組算數(shù)平均法(Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Mean,UPGMA)獲得最小生成樹,并以遺傳距離(p-distances)0.04為截?cái)嘀?分析白色念珠菌流行進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果:1.本研究通過(guò)分離、純化和鑒定,共獲得185株白色念珠菌臨床分離株;2.185株白色念珠菌主要來(lái)源于痰(103株,55.7%)、陰道或?qū)m頸分泌物(66株,35.7%)和尿液(10,5.4%);3.白色念珠菌對(duì)AMP B、5-FC、FCZ、ICZ和KETO耐藥率分別為0.0%、2.7%、7.0%、5.4%和2.7%;4.MLST基因分型共獲得122個(gè)雙倍體序列型(double sequence type,DST),其中DST2889~DST2899和DST2945~DST3032共99個(gè)為新發(fā)現(xiàn)DST,并已被Pub MLST數(shù)據(jù)庫(kù)收錄;5.MLST分型的7個(gè)管家基因片段核苷酸序列共2883bp,其中發(fā)現(xiàn)SNP有86個(gè)(3.1%)。片段AAT1a、AAC1、ADP1、MPIb、SYA1、VPS13和ZWF1b分別發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)7個(gè)(7/373,1.9%)、10個(gè)(10/407,2.5%)、16個(gè)(16/443,3.6%)、16個(gè)(16/375,4.3%)、9個(gè)(9/391,2.3%)、16個(gè)(16/403,4.0%)和16個(gè)(16/491,3.3%);6.聚類分析發(fā)現(xiàn),白色念珠菌分為12個(gè)進(jìn)化分支(n≥5),其中Clade 1含菌株數(shù)最多(56株,30.3%),其次分別是Clade 2(17株,9.2%)、Clade 3(16株,8.6%)、Clade 4(14株,7.6%)。結(jié)論:1.185株白色念珠菌抗真菌藥物敏感性與當(dāng)前國(guó)內(nèi)其他地區(qū)研究結(jié)果基本一致;2.本地區(qū)白色念珠菌臨床菌株之間有明顯的遺傳變異,122個(gè)雙倍體序列型中有99個(gè)是本研究新發(fā)現(xiàn)的,這些新發(fā)現(xiàn)的DST已被白色念珠菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)收錄;3.聚類分析發(fā)現(xiàn)白色念珠菌分為12個(gè)進(jìn)化分支,Clade 1菌株數(shù)量最多,是本地區(qū)白色念珠菌感染的優(yōu)勢(shì)菌群。第二部分白色念珠菌Ca Htr Ap絲氨酸蛋白酶功能初探目的:闡明白色念珠菌Ca Htr A蛋白(high-temperature requirement A protein,Ca Htr Ap)絲氨酸蛋白酶功能,并檢測(cè)水解活性絲氨酸殘基對(duì)其功能的影響。篩選與Ca Htr Ap相互作用的白色念珠菌蛋白,為進(jìn)一步研究Ca Htr Ap功能及其在白色念珠菌致病過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。方法:1.使用NCBI Conserved domain prediction在線工具分析Ca Htr Ap保守結(jié)構(gòu)域;2.使用Psort II在線工具分析Ca Htr Ap前導(dǎo)序列,并預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位;3.使用軟件Clustal X1.86比對(duì)分析Ca Htr Ap結(jié)構(gòu)域及其同源蛋白氨基酸序列;4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出Ca Htr Ap N端功能Deg Q結(jié)構(gòu)域(定義為Ca Htr A1p)基因,將其定向克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒p ET-28c中,構(gòu)建成重組質(zhì)粒p ET28c-Htr A1;利用overlap PCR原理將Ca Htr A1p絲氨酸殘基Ser219和Ser220突變成Cys或Ala,構(gòu)建成重組質(zhì)粒p ET28c-Htr A1S219A、p ET28c-Htr A1S219C、p ET28c-Htr A1S220A、p ET28c-Htr A1S220C和p ET28c-Htr A1S219/220A;重組表達(dá)質(zhì)粒使用菌液PCR、雙酶切鑒定和DNA測(cè)序進(jìn)行確認(rèn);5.使用半乳糖苷類似物IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達(dá),使用超聲波破碎細(xì)胞壁后收集總蛋白,并利用鎳離子親和層析純化融合蛋白;6.利用體外酶活性檢測(cè)反應(yīng),檢測(cè)Ca Htr A1p及其活性絲氨酸殘基突變體蛋白降解絲氨酸蛋白酶特異性底物β-casein活性,驗(yàn)證Ca Htr A1p絲氨酸蛋白酶功能,以及Ser219和Ser220對(duì)其蛋白酶活性的影響;7.通過(guò)使用融合蛋白Ca Htr A1p免疫Babl/c小鼠制備抗Ca Htr A1p多克隆抗體;8.利用免疫熒光技術(shù),驗(yàn)證Ca Htr Ap亞細(xì)胞定位;9.使用體外免疫共沉淀技術(shù)和質(zhì)譜分析,篩選與Ca Htr Ap相互作用的白色念珠菌蛋白。質(zhì)譜分析陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn):唯一匹配肽段計(jì)數(shù)(Unique Pep Count)≥2。結(jié)果:1.保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),Ca Htr Ap為雙Deg Q結(jié)構(gòu)域蛋白,由2個(gè)絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域和4個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域組成;N端Deg Q結(jié)構(gòu)域有胰酶樣絲氨酸蛋白酶保守的 催化三分子(catalytic triad)‖(His105-Asp136-Ser220)基序(motif);2.Psort II分析結(jié)果表明,Ca Htr Ap沒(méi)有N端前導(dǎo)序列,也沒(méi)有核定位信號(hào),被預(yù)測(cè)為胞質(zhì)蛋白;3.氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),Ca Htr Ap N端Deg Q具有催化三分子,預(yù)測(cè)的活性絲氨酸殘基Ser220附近有保守序列GSSGS,Ser219為Ser220鄰近絲氨酸;而C端Deg Q結(jié)構(gòu)域功能缺失;4.菌液PCR、雙酶切鑒定和DNA測(cè)序結(jié)果表明,重組原核表達(dá)質(zhì)粒p ET28c-Htr A1、p ET28c-Htr A1S219A、p ET28c-Htr A1S219C、p ET28c-Htr A1S220A、p ET28c-Htr A1S220C和p ET28c-Htr A1S219/220A構(gòu)建成功;5.體外誘導(dǎo)表達(dá)、純化和濃縮融合蛋白,融合蛋白Ca Htr A1p、Ca Htr A1S219Ap、Ca Htr A1S219Cp、Ca Htr A1S220Ap、Ca Htr A1S220Cp和Ca Htr A1S219A/S220Ap定量濃度分別為2.4 mg/m L、1.84 mg/m L、2.00 mg/m L、1.52 mg/m L、1.45mg/m L和1.90 mg/m L;6.體外蛋白酶活性驗(yàn)證結(jié)果表明,Ca Htr A1p能夠降解底物β-casein,具有絲氨酸蛋白酶活性;在酶活性反應(yīng)中,實(shí)驗(yàn)組Ca Htr A1p、Ca Htr A1S219Cp、Ca Htr A1S220Cp、Ca Htr A1S220Ap、Ca Htr A1S219A/S220Ap和Ca Htr A1S219Ap對(duì)底物β-casein的降解效率分別為0.84、0.74、0.66、0.46、0.42和0.35;7.Ca Htr Ap免疫熒光結(jié)果表明:Ca Htr Ap定位于細(xì)胞質(zhì),可能在細(xì)胞膜附近起作用;熒光半定量分析發(fā)現(xiàn)假菌絲細(xì)胞Ca Htr Ap表達(dá)水平顯著高于酵母相細(xì)胞(單位細(xì)胞面積光密度值0.23 vs.0.15,p=0.002);8.免疫共沉淀技術(shù)和質(zhì)譜分析共篩選出8個(gè)與Ca Htr Ap相互作用蛋白,包括3個(gè)核糖體亞基蛋白(RPL3、RPS9B和RPS3)以及延伸因子1(elongation factor1-alpha,TEF1)、肌動(dòng)蛋白(actin 1,ACT1)、泛醇色素C還原酶亞基2(ubiquinol-cytochrome c reductase core subunit 2,QCR2)、細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,TRI4)和二氫硫辛酰胺脫氫酶(dihydrolipoamide dehydrogenase 1,LPD1)。結(jié)論:1.Ca Htr A1p具有胰酶樣絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域和典型的絲氨酸蛋白酶活性;2.Ser219和Ser220都對(duì)Ca Htr A1p蛋白酶活性有重要影響,而且兩者之間存在協(xié)同效應(yīng);3.Ca Htr Ap是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白,可能與假菌絲形成有關(guān);4.本研究篩選出與Ca Htr Ap相互作用的白色念珠菌蛋白8個(gè),包括TEF1、ACT1、QCR2、TRI4、LPD1、RPL3、RPS9B和RPS3。
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【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R519.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2333333