【摘要】：目的：研究SFTSV糖蛋白Gn的體液和細(xì)胞免疫原性。方法：1.參考SFTSV HB29病毒株的糖蛋白Gn編碼基因(GenBank:HM745931.1),優(yōu)化編碼Gn的密碼子,氨基酸序列保持不變。化學(xué)合成得到的野生型序列WSP-Gn經(jīng)PCR反應(yīng)分別在WSP-Gn的5’端和3’端引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn),在Gn的5’端和3’端引入NheⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn),然后將上述序列分別克隆到真核表達(dá)載體pJW4303,構(gòu)建重組質(zhì)粒pJW4303-WSP-Gn和pJW4303-tPA-Gn。化學(xué)合成得到的密碼子優(yōu)化型序列WSP-Gn-opt經(jīng)PCR反應(yīng)分別在Gn-opt的5’端和3’端引入NheⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn),克隆到pJW4303載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pJW4303-tPA-Gn-opt。2.以上述重組質(zhì)粒和空載體pJW4303分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清和裂解液,Western blot檢測糖蛋白Gn的表達(dá)。3.將上述重組質(zhì)粒及空載體p.1W4303以肌肉注射、活體基因?qū)敕绞矫庖連ALB/c小鼠,免疫時(shí)間點(diǎn)為第0、2、4、8周,分別在每次免疫前和第6、10周進(jìn)行內(nèi)眥采血收集血清。通過ELISA法檢測各個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠血清中特異性IgG、 IgG1、 IgG2a水平。4.通過生物信息學(xué)方法預(yù)測Gn的CTL表位肽,優(yōu)選其中的16條(P1-P16)用Elispot方法篩選并進(jìn)行后續(xù)研究。按上述方法分別于第0、2、4周免疫BALB/c小鼠,在第7、17、31、60、90天分批處死小鼠取脾細(xì)胞,用Elispot技術(shù)檢測分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞。結(jié)果：1.酶切鑒定和基因測序正確,即成功構(gòu)建SFTSV糖蛋白Gn表達(dá)質(zhì)粒pJW4303-WSP-Gn, pJW4303-tPA-Gn和pJW4303-tPA-Gn-opt。2.糖蛋白Gn在293T細(xì)胞的表達(dá)：pJW4303-WSP-Gn和pJW4303-tPA-Gn編碼Gn可在HEK293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；pJW4303-tPA-Gn-opt編碼Gn在HEK293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并分泌到細(xì)胞外。3.體液免疫應(yīng)答:pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt均能誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生抗Gn特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體；pJW4303-tPA-Gn-opt誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體較pJW4303-WSP-Gn和pJW4303-tPA-Gn免疫組出現(xiàn)時(shí)間更早、滴度更高,且IgG2a/IgG1接近1,其誘導(dǎo)的Th免疫應(yīng)答更趨于平衡。4.CTL免疫應(yīng)答：肽P1、P10能夠刺激重組質(zhì)粒免疫小鼠淋巴細(xì)胞分泌IFN-y,且P10相對于P1誘導(dǎo)的CTL免疫應(yīng)答更強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間更久；P1刺激組,pJW4303-WSP-Gn誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答較其它兩組為優(yōu),P10刺激組,pJW4303-tPA-Gn-opt誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答較其它兩組為優(yōu)。結(jié)論：1.SFTSV糖蛋白Gn具有良好的體液免疫原性和細(xì)胞免疫原性；2.P1、P10是SFTSV糖蛋白Gn的CTL表位肽。
[Abstract]:Objective: to study the humoral and cellular immunogenicity of SFTSV glycoprotein Gn. Method 1: 1. Referring to the glycoprotein Gn encoding gene (GenBank:HM745931.1) of SFTSV HB29 strain, the codon encoding Gn was optimized and the amino acid sequence remained unchanged. The wild-type WSP-Gn was chemically synthesized by PCR reaction to introduce Hind 鈪，

本文編號：2290017