發(fā)布時(shí)間：2018-10-16 22:16

【摘要】：【研究背景及目的】 在各種病因所導(dǎo)致的肝損傷中，機(jī)體免疫介導(dǎo)所致肝細(xì)胞損傷占有重要的地位，盡管具體機(jī)制復(fù)雜，但免疫細(xì)胞的活化均是其始動(dòng)因素。本研究室的前期數(shù)據(jù)首次闡述了NK細(xì)胞在病毒誘導(dǎo)的重度肝細(xì)胞損傷中至關(guān)重要。通過(guò)對(duì)比研究重型乙型肝炎和輕中度慢性乙型肝炎患者的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)鉀離子通道相關(guān)基因KCTD9的表達(dá)與疾病的嚴(yán)重程度即肝損傷的程度高度正相關(guān)，在重型肝炎患者淋巴細(xì)胞胞核中該分子高度表達(dá)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其表達(dá)主要在重型肝炎患者肝組織和外周血NK細(xì)胞。初步體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯示，該分子的高表達(dá)與NK細(xì)胞的活化和功能具有緊密聯(lián)系[1-3]。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該分子與新型接頭蛋白SHB分子具有緊密功能關(guān)聯(lián)，而SHB分子與IL-2受體信號(hào)途徑和PI3K途徑相關(guān)[4]。據(jù)此我們提出KCTD9分子可能是NK免疫細(xì)胞活化過(guò)程中的關(guān)鍵分子之一，并可能通過(guò)SHB蛋白參與免疫細(xì)胞活化過(guò)程。本研究針對(duì)KCTD9和SHB基因構(gòu)建相對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽質(zhì)粒，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證KCTD9分子和SHB分子之間是否存在功能關(guān)聯(lián)，，為進(jìn)一步揭示NK細(xì)胞及其表達(dá)的KCTD9分子在重型乙型肝炎肝損傷發(fā)生和發(fā)展中的作用及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 【研究方法】 利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建在氨基端含有His標(biāo)記的His-KCTD9融合蛋白載體pHis-KCTD9和在氨基端含有FLAG標(biāo)記的FLAG-SHB融合蛋白載體pFLAG-SHB,采用HEK293T細(xì)胞、jurkat細(xì)胞及NK92細(xì)胞共轉(zhuǎn)染和免疫共沉淀法驗(yàn)證KCTD9與SHB分子的相互作用。 【研究結(jié)果】 成功構(gòu)建了氨基端含有His標(biāo)記的His-KCTD9融合蛋白載體pHis-KCTD9和在氨基端含有FLAG標(biāo)記的融合蛋白FLAG-SHB的載體pFLAG-SHB。成功共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞、jurkat細(xì)胞及NK92細(xì)胞后，采用免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)KCTD9與SHB分子無(wú)結(jié)合。 【研究結(jié)論】 成功構(gòu)建了pHIS-hKCTD9和pFLAG-hSHB真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步推斷：KCTD9蛋白與SHB蛋白之間不存在直接相互作用。鑒于此KCTD9究竟是通過(guò)與哪一種蛋白分子的相互作用發(fā)揮其免疫學(xué)功能值得進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Background and objective: immune mediated hepatocyte injury plays an important role in liver injury caused by various etiology. Although the specific mechanism is complicated, the activation of immune cells is the initiator of liver injury. The preliminary data of this study demonstrated for the first time the importance of NK cells in viral induced severe hepatocyte injury. By comparative study of gene expression profiles in patients with severe hepatitis B and mild to moderate chronic hepatitis B, it was found that the expression of potassium channel associated gene KCTD9 was highly positively correlated with the severity of the disease, that is, the degree of liver injury. This molecule is highly expressed in lymphocyte nuclei of patients with severe hepatitis. It was further found that its expression was mainly in NK cells of liver and peripheral blood of patients with severe hepatitis. The results of in vitro experiments showed that the overexpression of this molecule was closely related to the activation and function of NK cells [1-3]. Through bioinformatics analysis, it was found that this molecule is closely related to the SHB molecule, while the SHB molecule is related to the IL-2 receptor signaling pathway and the PI3K pathway [4]. Therefore, we suggest that KCTD9 may be one of the key molecules in the activation of NK immune cells, and may participate in the activation of immune cells through SHB protein. In this study, the corresponding tag plasmids of KCTD9 and SHB genes were constructed to verify whether there was a functional correlation between KCTD9 molecules and SHB molecules in vitro. In order to further reveal the role and mechanism of NK cells and their expressed KCTD9 molecules in the occurrence and development of liver injury in severe hepatitis B. the molecular cloning technique was used. Construction of His-KCTD9 fusion protein vector pHis-KCTD9 with His labeling at amino terminal and FLAG-SHB fusion protein pFLAG-SHB, labeled with FLAG at amino end using HEK293T cells, cotransfection of jurkat cells and NK92 cells and immunocoprecipitation method to verify the phase of KCTD9 and SHB molecules Interaction. [results] the vector pFLAG-SHB. containing His labeled His-KCTD9 fusion protein pHis-KCTD9 at amino terminal and FLAG-SHB labeled with FLAG at amino terminal was successfully constructed. After successful cotransfection of HEK293T cells, jurkat cells and NK92 cells, no binding between KCTD9 and SHB molecules was found by immunoprecipitation method. [conclusion] Eukaryotic expression plasmids of pHIS-hKCTD9 and pFLAG-hSHB were constructed successfully. Through in vitro experiments, we infer that there is no direct interaction between KCTD9 protein and SHB protein. Therefore, the immunological function of KCTD9 through interaction with which protein molecules is worthy of further study.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.62

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：2275794