發(fā)布時間：2018-09-08 09:03

【摘要】：背景和目的 淋巴細胞活化基因-3分子(lymphocyte activation gene-3, LAG-3)是一種獨立免疫負調(diào)節(jié)分子,具有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和參與免疫調(diào)節(jié)的功能,與慢性病毒感染導致的CD8+T細胞耗竭密切相關(guān)。慢性乙型肝炎的發(fā)病機理主要是一種免疫病理反應(yīng),HBV持續(xù)感染與特異性CD8+T淋巴細胞應(yīng)答功能低下有關(guān)。本文主要探討LAG-3與慢性乙肝疾病進展的關(guān)系,為尋求新的抗病毒治療策略提供新的思路。 對象和方法 1研究對象 篩選2012年2月～2013年6月在浙江大學附屬第一醫(yī)院感染科門診和住院HBV感染者90例,同時以18例正常健康人作為對照組,結(jié)合臨床資料將其分為三組,分別為：慢性乙型肝炎患者組、慢性無癥狀HBV攜帶者組及正常對照組。 2實驗方法 1)外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)分離空腹靜脈采集全血標本,采用Ficoll淋巴細胞分離液分離PBMC. 2)CD8+T淋巴細胞CD223的測定采用流式細胞技術(shù)測CD8+T淋巴細胞CD223(LAG-3)表達。 3)細胞內(nèi)IFN-γ的測定采用流式細胞技術(shù)測定,通過破膜、染色,測定表達或不表達LAG-3的CD8+T細胞內(nèi)細胞因子IFN-γ的分泌差異。 4)LAG-3抗體阻斷對淋巴細胞分泌IFN-γ的影響(ELISPOT法)。 5)HBV病毒學指標的檢測HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe及抗HBc采用化學發(fā)光微粒子免疫法(CMIA)檢測；HBV-DNA定量采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測,截止值為103拷貝/m1。 6)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測定使用HITACHI7600-110型全自動生化分析儀測定。 7)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包及GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果 1)慢乙肝患者組淋巴細胞表面CD8+CD223+分布頻數(shù)明顯高于正常對照組和慢性HBV攜帶者組,有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 2)慢乙肝患者中ALT高DNA低組和ALT高DNA高組淋巴細胞表面CD8+CD223+分布頻數(shù)明顯高于正常對照組(P0.05)。而慢乙肝患者中ALT低DNA低組、ALT低DNA高組淋巴細胞表面CD8+CD223+分布頻數(shù)與正常對照組比,均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3)慢乙肝患者組及慢性HBV攜帶者組表面CD8+CD223分布頻數(shù)與相應(yīng)的ALT水平有明顯的正相關(guān)性。(P=0.03,r=0.23)。 4)慢乙肝患者PBMC中,IFN-γ+在CD8+CD223-細胞的分布頻數(shù)明顯高于其在CD8+CD223+細胞的分布頻數(shù)(P=0.02)。 5)慢乙肝患者PBMC在乙肝核心抗原及CD223抗體的作用下斑點形成細胞數(shù)明顯高于乙肝核心抗原刺激組(P0.01)、乙肝核心抗原加同型IgG組(P0.01)及乙肝核心抗原加PD-L1組(P=0.01)；慢乙肝患者PBMC在乙肝核心抗原加PD-L1及CD223抗體作用下斑點形成細胞數(shù)明顯高于乙肝核心抗原加PD-L1組(P=0.03)而其與乙肝核心抗原加CD223抗體組無顯著性差異(P0.05) 結(jié)論 1)慢性乙肝患者外周血CD8+T細胞表面LAG-3表達明顯增加,且與肝臟炎癥程度成正相關(guān),而與HBV DNA載量無關(guān)。 2)慢性乙肝患者中,高表達LAG-3的CD8+T細胞功能受損,表現(xiàn)為其分泌細胞因子IFN-γ的水平下降。 3)加入LAG-3抗體阻斷,可恢復慢性乙肝患者外周血CD8+T細胞功能,并且LAG-3抗體聯(lián)合PD-L1阻斷,對CD8+T細胞功能的恢復優(yōu)于單一PD-L1阻斷。
[Abstract]:Background and purpose
Lymphocyte activation gene-3 (LAG-3) is an independent negative immunoregulatory molecule, which can maintain the stability of the internal environment and participate in immune regulation. It is closely related to the depletion of CD8 + T cells caused by chronic virus infection. Continued infection is associated with low specific CD8 + T lymphocyte responsiveness. This article mainly discusses the relationship between LAG-3 and the progression of chronic hepatitis B, and provides new ideas for seeking new antiviral treatment strategies.
Objects and methods
1 object of study
Ninety outpatients and inpatients with HBV infection from February 2012 to June 2013 in the Department of Infections of the First Affiliated Hospital of Zhejiang University were selected and divided into three groups: chronic hepatitis B patients group, chronic asymptomatic HBV carriers group and normal control group.
2 experimental method
1) Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from fasting veins to collect whole blood samples, and then separated from PBMC by Ficoll lymphocyte isolation solution.
2) CD8+T lymphocyte CD223 was measured by flow cytometry to detect the expression of CD223 (LAG-3) in CD8+T lymphocytes.
3) Intracellular IFN-gamma was measured by flow cytometry. The secretion of cytokine IFN-gamma in CD8+T cells expressing or not expressing LAG-3 was determined by membrane breaking and staining.
4) the effect of LAG-3 antibody blocking on the secretion of IFN- gamma by lymphocytes (ELISPOT method).
5) HBsAg, anti-HBs, anti-HBeAg, anti-HBe and anti-HBc were detected by chemiluminescent microparticle immunoassay (CMIA), and HBV-DNA was detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) with a cut-off value of 103 copies/m1.
6) serum alanine aminotransferase (ALT) was determined by HITACHI7600-110 automatic biochemical analyzer.
7) Data were analyzed by SPSS 13.0 and GraphPad Prism5.
Result
1) The frequency of CD8 + CD223 + distribution on lymphocyte surface in patients with chronic hepatitis B was significantly higher than that in normal control group and chronic HBV carrier group (P 0.01).
2) The frequency of CD8+CD223+ distribution on lymphocyte surface in patients with chronic hepatitis B was significantly higher than that in normal control group (P 0.05) in patients with ALT high DNA and ALT high DNA. However, the frequency of CD8+CD223+ distribution on lymphocyte surface in patients with chronic hepatitis B was significantly higher than that in normal control group (P 0.05).
3) The frequency of CD8 + CD223 distribution on the surface of chronic hepatitis B patients and chronic HBV carriers was positively correlated with the corresponding ALT level (P = 0.03, r = 0.23).
4) In PBMC of patients with chronic hepatitis B, the frequency of IFN-gamma distribution in CD8+CD223-cells was significantly higher than that in CD8+CD223+ cells (P=0.02).
5) The number of dot forming cells of PBMC in patients with chronic hepatitis B was significantly higher than that in patients with hepatitis B core antigen and CD223 antibody stimulation group (P 0.01), hepatitis B core antigen plus homotype IgG group (P 0.01) and hepatitis B core antigen plus PD-L1 group (P = 0.01); PBMC in patients with chronic hepatitis B was dot-shaped in patients with hepatitis B core antigen plus PD-L1 and CD223 antibody. The number of adult cells was significantly higher than that of hepatitis B core antigen plus PD-L1 group (P=0.03), but there was no significant difference between hepatitis B core antigen plus CD223 antibody group (P 0.05).
conclusion
1) The expression of LAG-3 on peripheral blood CD8 + T cells in patients with chronic hepatitis B was significantly increased, and was positively correlated with the degree of hepatitis, but not with HBV DNA load.
2) In patients with chronic hepatitis B, the function of CD8 + T cells with high LAG-3 expression is impaired, and the level of IFN-gamma secreted by CD8 + T cells is decreased.
3) The function of CD8+T cells in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B could be restored by adding LAG-3 antibody, and the function of CD8+T cells could be restored by LAG-3 antibody combined with PD-L1 blockade.
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62

【共引文獻】

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本文編號：2230065