【摘要】：研究背景： 結(jié)核病（Tuberculosis，TB）一直是一個備受關(guān)注的全球性健康問題，迄今為止，關(guān)于結(jié)核病的發(fā)病機制，特別是機體對結(jié)核感染的免疫機制并未完全闡明。近年來，具有天然免疫樣作用的γδ T細胞在結(jié)核感染中的免疫作用，已經(jīng)得到眾多研究者的實驗研究和臨床觀察的證實。IL-17是一種重要的促炎性細胞因子，近年來研究感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）以及卡介苗感染的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，分泌IL-17的細胞主要來源于γδ T細胞。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在正常人外周血中存在產(chǎn)生IL-17的γδ T細胞,而且這些細胞在結(jié)核病患者外周血中是增高的，提示產(chǎn)生IL-17的γδ T細胞可能涉及TB的發(fā)病過程。雖然有研究指出，人γδ T細胞在磷酸化抗原刺激下加入誘導性的細胞因子誘導培養(yǎng)，也可以誘導分泌IL-17，但Mtb多肽類抗原如Mtb耐熱抗原（Mtb-HAg）和多克隆抗體如抗TCR-γδ抗體刺激人γδ T細胞后對極化細胞因子誘導分化γδ T細胞產(chǎn)生IL-17有何作用和影響尚不清楚。另外，誘導人γδ T細胞分化的培養(yǎng)條件的研究，，以及產(chǎn)生IL-17的健康人γδ T細胞屬于何種亞群，也有待進一步探討。 目的： 探討Mtb耐熱抗原（Mtb-HAg）和抗TCR-γδ抗體在刺激人γδ T細胞誘導分化產(chǎn)生IL-17中的作用。檢測和分析健康人γδ T細胞的不同亞群經(jīng)誘導極化后產(chǎn)生IL-17有何不同，以探討健康人γδ T細胞不同亞群產(chǎn)生IL-17的作用。 方法： 1.采集健康人外周血單個核細胞（PBMC）經(jīng)過免疫磁珠分選得到純化的γδ T細胞后，加入Mtb-HAg或包被的抗TCR-γδ純化抗體，再加或不加CD28單抗進行刺激，同時加或不加IL-17極化細胞因子組合（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）誘導培養(yǎng)10-12d。然后收集誘導極化培養(yǎng)的γδ T細胞，經(jīng)PMA和Ionomycin再刺激6h后，用ELISPOT的方法檢測產(chǎn)生IL-17的細胞數(shù)。 2.采集健康人外周血濃縮白細胞（buffy coat cell）分離PBMC后冷凍保存。取凍存的PBMC復蘇后經(jīng)MACS得到純化的γδ T細胞，用含10%NBS或人AB血清的IMDM培養(yǎng)液或RPMI-1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每孔均加入抗TCR-γδ抗體，CD28單抗以及IL-17極化細胞因子組合（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)10-12d時，收集誘導極化培養(yǎng)的γδ T細胞，經(jīng)PMA和Ionomycin再刺激6h后，用ELISPOT的方法檢測不同培養(yǎng)液培養(yǎng)下產(chǎn)生IL-17的細胞數(shù)。 3.復蘇經(jīng)凍存的健康人的PBMC，免疫磁珠分選法分選γδ T細胞，得到Vδ2+γδ T細胞和Vδ2 γδ T細胞兩個亞群，用含10%人AB血清的IMDM培養(yǎng)液細胞濃度后加入抗TCRγδ抗體、CD28單抗以及IL-17極化細胞因子組合（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）誘導培養(yǎng)10-12d，收集細胞，經(jīng)PMA和Ionomycin再刺激6h后，用ELISPOT的方法檢測γδ T細胞兩個亞群產(chǎn)生IL-17的細胞數(shù)。 結(jié)果： 1、經(jīng)刺激和誘導分化培養(yǎng)的γδ T細胞用ELISPOT方法檢測產(chǎn)生IL-17的細胞數(shù)（每105個γδ T細胞）發(fā)現(xiàn)，抗TCR-γδ+CKs組（67±33）比抗TCR-γδ組（6±3）比明顯增加（P＜0.01），抗TCR-γδ+CD28單抗+CKs組（185±54）與抗TCR-γδ+CKs組（67±33）比明顯增多（P＜0.01）。Mtb-HAg+CD28單抗+CKs組（74±41）與抗TCR-γδ+CD28單抗+CKs組（185±54）比顯著減少，但與Mtb-HAg+CD28單抗組（19±12）比明顯增多（P＜0.05）。 2、純化的γδ T細胞用含10%NBS的RPMI-1640或IMDM作為培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，在相同的誘導極化條件下培養(yǎng)10-12d后ELISPOT檢測發(fā)現(xiàn)，用IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)的組（333±46）產(chǎn)生IL-17的γδ T細胞數(shù)（每105個γδ T細胞）與用RPMI-1640培養(yǎng)液的組（56±38）比明顯增多（P＜0.01）。 3、來源于新鮮的PBMC或凍存的PBMC經(jīng)免疫磁珠分選得到的γδ T細胞在相同的誘導培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10-12d后ELISPOT檢測，來源于新鮮的PBMC經(jīng)純化后得到的γδ T經(jīng)誘導極化產(chǎn)生IL-17的量明顯高于比來源于凍存的PBMC（P＜0.01）。 4、復蘇凍存的PBMC后免疫磁珠分選得到純化的γδ T細胞，分別用含10%NBS的IMDM培養(yǎng)液和含10%人AB血清的IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)，在相同的誘導極化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10-12d后ELISPOT檢測發(fā)現(xiàn)，含人AB血清的培養(yǎng)液組與含10%NBS的培養(yǎng)液組相比明顯增多（P＜0.01）。 5、培養(yǎng)后Vδ2－γδ T細胞中Vδ3-8亞群所占比例＞50%時，Vδ2－γδ T細胞產(chǎn)生IL-17的細胞數(shù)（1537±1193）與Vδ2+γδ T細胞（579±420）相比明顯增多（P＜0.05）。而培養(yǎng)后Vδ2－γδ T細胞中Vδ3-8亞群所占比例＜50%時，Vδ2－γδ T細胞產(chǎn)生IL-17的細胞數(shù)（491±745）與Vδ2+γδ T細胞（1729±1315）相比明顯減少（P＜0.01）。 結(jié)論： 1、在正常健康人γδ T細胞經(jīng)Mtb-HAg或抗TCR-γδ抗體激活后，誘導Th17分化的細胞因子（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）也能誘導IL-17+γδ T細胞分化。CD28在協(xié)同抗TCR-γδ抗體激活γδ T細胞誘導產(chǎn)生IL-17的過程中也有重要作用。 2、抗TCR-γδ抗體刺激誘導IL-17+γδ T細胞分化比Mtb-HAg的作用更強。 3、誘導人γδ T細胞產(chǎn)生IL-17時用IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)可產(chǎn)生更多的IL-17+γδ T細胞，提示其與芳香烴受體的參與有關(guān)。 4、在正常人外周血γδ T細胞中產(chǎn)生IL-17的細胞主要以Vδ3-8亞群為主，其次為Vδ2亞群，Vδ1亞群中最少。
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【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R52

【參考文獻】

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本文編號：2227451