【摘要】：研究背景丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)引起的急、慢性肝病表現(xiàn)為很寬的臨床譜,從癥狀輕到肝功能衰竭,慢性丙型肝炎患者有20%-30%在10-30年后進展為肝硬化,甚至肝癌。目前全球約有1.8億人口感染HCV。HCV的流行率高,慢性率高,抗HCV篩查不能可靠的避免其經(jīng)輸血途徑傳播,又無疫苗預(yù)防及特異性的抗病毒藥物,迄今HCV感染仍是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。HCV是單股正鏈RNA病毒,由于復(fù)制所依賴的多聚酶缺乏校對功能,HCV基因序列易發(fā)生突變,從而呈現(xiàn)一定的異質(zhì)性。HCV基因型和亞型的區(qū)分是根據(jù)基因組核苷酸序列的差異程度,前者的序列差異度為30-35%,后者為20-25%。目前,HCV可分為6種基因型和80多種基因亞型。HCV基因型的分布具有明顯的地域和人種分布特征。但HCV基因型的分布并非一成不變的,隨著HCV傳播方式的改變以及全球人口的遷移和流動以及,各地區(qū)的HCV基因型分布也在發(fā)生變化。有研究表明在一些國家如法國、意大利、波蘭、德國等國家HCV基因型分布正在發(fā)生變化。隨著我國經(jīng)濟的迅猛發(fā)展,國內(nèi)外及國內(nèi)不同地區(qū)之間在各個領(lǐng)域的交流增多,人口流動性增強,這為HCV在人群中快速傳播流行提供了環(huán)境。在我國1993年對獻血者實施HCV抗體篩查之后,丙肝的傳播途徑也由原來以輸血傳播為主到以輸血、吸毒、紋身、性傳播等多種途徑并存的現(xiàn)象。HCV的傳播方式的改變以及人口的大規(guī)模流動,使我國HCV基因型的分布也在發(fā)生改變。我國主要HCV基因亞型為1b亞型,其次為2a亞型,北方地區(qū)2a亞型患者比例比南方地區(qū)高。華南地區(qū)1997-2002年間研究報道的HCV 1b亞型的流行率是90%左右,2a亞型是8%左右,未見6a亞型報道。2005年Lu等調(diào)查發(fā)現(xiàn),華南地區(qū)珠三角三城市66例樣本中1b亞型的比例為66.7%,6a亞型所占比例21.2%,已超過2a亞型的比例(7.6%)成為僅次于1b亞型的第二大基因型。但是因為研究樣本量較少,結(jié)論需要進一步證實。影響慢性丙型肝炎抗病毒治療療效的病毒因素包括HCV基因型、病毒Core和NS5A區(qū)突變、治療前病毒載量等因素。現(xiàn)已公認(rèn),HCV基因型與臨床抗病毒治療療效及療程有關(guān)聯(lián)。2004年我國發(fā)布的《丙型肝炎防治指南》和2009年美國肝病研究協(xié)會(AASLD)的《丙型肝炎的臨床實踐指南》(更新版)中均明確指出：1型的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答比2、3型低；推薦1型的治療療程為48周,而非1型(2/3型)的療程為24周,1型和非1型患者的利巴韋林的劑量也不同。由此可見,HCV基因型對指導(dǎo)慢性丙型肝炎患者抗病毒治療具有重要的臨床意義。由于HCV 6型分布地區(qū)較為局限,關(guān)于該基因型的抗病毒治療結(jié)局和影響因素報道不多。鑒于我國華南地區(qū)HCV 6a亞型的快速流行趨勢,加快對6a亞型慢性丙型肝炎的臨床特征、抗病毒治療療效、預(yù)測因素以及與lb亞型的差異等研究,具有重要的臨床意義。慢性丙型肝炎標(biāo)準(zhǔn)治療方案(SOC)是聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療,從全球來看患者病毒學(xué)應(yīng)答率在50%左右。SOC方案治療有很多副作用和禁忌癥,且花費昂貴,致使部分患者無法完成全程治療或無法接受該治療方案。因此,積極探索能夠預(yù)測抗病毒治療療效的因素對患者避免治療帶來的高風(fēng)險、將藥物的毒副作用降低到最低以及合理的進行個體化治療,具有重要的臨床實踐意義。2009年以來,全球多項研究發(fā)現(xiàn)人基因組編碼干擾素的基因IL28B附近rs12979860和rs8099917位點單核苷酸多態(tài)性與聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療應(yīng)答有關(guān),這一發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著在HCV研究領(lǐng)域?qū)λ拗髯饔玫恼J(rèn)識進入新的階段。同時探索尋求快速、簡單、可靠的IL28B多態(tài)性檢測方法,也成為近年與該領(lǐng)域相關(guān)的研究熱點之一。長期以來,HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)模型研究進展緩慢。直到2005年日本學(xué)者Wakita等成功地建立了HCV 2a (JFHl)型全基因組細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),該細(xì)胞培養(yǎng)體系的全長JFH1 RNA能夠有效復(fù)制并分泌感染性病毒顆粒。它的構(gòu)建在HCV細(xì)胞培養(yǎng)模型發(fā)展史上具有里程碑式的意義。由于不同HCV基因型的生物學(xué)特點及對抗病毒治療應(yīng)答存在差異,2a亞型細(xì)胞培養(yǎng)模型并不能滿足HCV相關(guān)研究需要,隨后許多學(xué)者積極探索構(gòu)建其他基因型的全基因組細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),但收獲不多。近年,在JFH1細(xì)胞培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上來進行改造,構(gòu)建其他基因型與JFH1嵌合病毒細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)取得了一些進展。目前已報道的嵌合病毒細(xì)胞培養(yǎng)體系包括1a、1b、2a、3a、4a、2b、5a、6a、7a等,而HCV 6a犁全基因組細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)未見報道。鑒于目前HCV 6a亞型在我國華南地區(qū)快速增長和流行,并有向全國傳播趨勢。加快對我國6a亞型的生物學(xué)特點、疫苗研發(fā)、抗病毒藥物的評價和篩選等已成為我國丙型肝炎防治研究的迫切需要。因此,有必要盡快建立我國6a亞型流行毒株細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。研究目的基于前期我們研究團隊對HCV基因型的初步研究結(jié)果,本研究旨在通過擴大樣本以調(diào)查我國華南地區(qū)慢性丙型肝炎的HCV基因亞型分布情況與特征,分析該地區(qū)HCV基因亞型流行和變遷,探討HCV基因亞型流行模式轉(zhuǎn)變的原因和6a亞型病毒株的進化來源。對比分析我國華南地區(qū)HCV 1b和6a亞型慢性丙型肝炎的臨床特征,比較兩組患者的抗病毒治療結(jié)局差異,探討影響病毒學(xué)應(yīng)答的因素。建立一種與慢性丙型肝炎抗病毒治療應(yīng)答相關(guān)的IL28B rs8099917基因多態(tài)性檢測方法,并應(yīng)用該方法檢測rs8099917基因型,分析該位點基因型與治療結(jié)局的關(guān)系。利用JFH1(2a)可高效細(xì)胞培養(yǎng)的特性,以JFH1序列為骨架,構(gòu)建HCV 6a/JFH1重組病毒,為下一步構(gòu)建6a亞型全基因細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)奠定實驗基礎(chǔ),以期為我國HCV 6a病毒株的生物學(xué)特點、相關(guān)免疫學(xué)特征、疫苗研制、抗病毒藥物的評價和篩選等提供實驗技術(shù)平臺。研究方法1.慢性丙型肝炎的病毒基因型和亞型的分布：通過比對分析我國HCV主要流行基因亞型的序列,改進HCV基因分型引物,選擇C/E1和NS5B區(qū)PCR擴增測序分型。回顧性收集患者年齡、性別、病毒載量、感染時間及傳播途徑等資料,多因素分析HCV基因型/亞型與這些因素的關(guān)系。2.影響慢性丙型肝炎抗病毒治療療效的病毒與宿主因素研究：建立華南地區(qū)1b亞型和6a亞型慢性丙型肝炎臨床對照研究,所有患者應(yīng)用聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療48周,并隨訪至少24周。收集患者抗病毒治療前臨床基線資料：性別、年齡、HCV RNA定量、ALT、AST、TBIL、ALB、TG、CHOL、 GLU、WBC、NEU、RBC、PLT、HGB等資料,記錄抗病毒治療期間4、12、48周以及治療結(jié)束隨訪24周時HCV RNA定量。比較分析兩組患者的臨床一般特征以及抗病毒治療應(yīng)答差異,分析影響病毒學(xué)應(yīng)答的因素。3.與抗病毒療效相關(guān)的IL28B多態(tài)性檢測方法的建立與應(yīng)用：根據(jù)四引物擴增受阻突變體系聚合酶鏈反應(yīng)方法(T-ARMS-PCR)的原理,設(shè)計兩對引物,特異性擴增鑒定IL28B rs8099917基因型,并通過直接測序和設(shè)置陽性參照評價T-ARMS-PCR方法的特異性。應(yīng)用該方法對我國慢性丙型肝炎患者IL28B rs8099917基因型進行檢測,對IL28B另一位點rs12979860直接測序法鑒定基因型,分析兩位點基因多態(tài)性與抗病毒治療療效的關(guān)系。4.我國華南地區(qū)6a/JFH1重組病毒的構(gòu)建：應(yīng)用重疊延伸PCR方法分別擴增華南地區(qū)HCV 6a亞型Core-NS2基因和JFH1兩基因片段,進行基因融合連接,酶切連接構(gòu)建6a/JFH1重組病毒質(zhì)粒。5.統(tǒng)計學(xué)方法：計數(shù)資料采用卡方檢驗；計量資料兩組之間比較t檢驗或非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗,計量資料三組之間比較采用方差分析；HCV基因型與相關(guān)因素的關(guān)系采用多分類Logistic回歸分析；探討慢性丙型肝炎患者獲得SVR的預(yù)測因子應(yīng)用二分類Logistic回歸分析。P值小于0.05時有顯著性差異,所有統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS13.0。結(jié)果1.388例慢性丙型肝炎患者中,檢測出HCV基因型有8種：1a、1b、2a、2b、3a、3b、6a和6d,各種基因亞型的例數(shù)分別為5例(1.3%)、230例(59.3%)、31例(8.0%)、1例(0.3%)、30例(5.2%)、16例(4.1%)、84例(21.6%)和1例(0.3%)。2.不同HCV基因型患者的平均年齡有顯著性差異(p0.001)。與6a亞型患者相比,感染1b和2/3型患者的平均年齡大(34.9±8.6歲vs.42.7±15.3歲和40.2±10.7歲)。在大于25歲以上年齡組中,1b亞型的比例隨年齡增大有增多趨勢,而6a亞型的比例有隨年齡增大有減少趨勢。3.不同HCV基因型患者的性別分布有顯著性差異(p=0.011)。感染2/3型和6a亞型的男性患者比例明顯高于女性(67.6%vs.32.4%和76.2%vs.23.8%)。4.不同HCV基因型患者的傳播途徑有明顯差異(p0.001)。通過輸血或血制品感染HCV的患者中1b亞型的比例是80.5%,經(jīng)靜脈吸毒感染HCV患者中6a亞型的比例是63.3%。117例有明確輸血或血制品時間的lb亞型患者中,1995年之前感染HCV的患者比例高達84.6%(99/117),而在1995年之后,通過此途徑感染的患者比例顯著下降并維持一定水平。5.多因素Logistic回歸表明,HCV基因型與傳播途徑獨立相關(guān)。1b亞型與輸血或血制品途徑相關(guān)(P0.001),而6a亞型與經(jīng)靜脈吸毒途徑相關(guān)(P0.001)。6.進化樹分析顯示,我國華南地區(qū)慢性丙型肝炎的6a亞型病毒株與香港6a亞型病毒株有高度的相似性,二者在進化距離上與越南6a亞型病毒株更接近。7.本研究共納入47例lb亞型和41例6a亞型慢性丙型肝炎患者,兩組患者在抗病毒治療前的性別分布、平均年齡,以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血清白蛋白、總膽紅素、甘油三酯、膽固醇、血糖、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、HCV RNA定量等水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均大于0.05)。8.88例慢性丙型肝炎患者,總體SVR率為71.6%(63/88)。與lb亞型患者相比,6a亞型患者有較高的RVR和SVR(92.7%vs.66%,P=0.002和85.4%vs.59.6%,P=0.007)；但兩組患者的EVR和ETVR無顯著性差異(95.1%vs.87.2%,P=0.362和95.1%vs.91.5%,P=0.802)。9.多變量Logistic回歸分析影響SVR的因素表明,在抗病毒治療前,HCV基因型(0R=3.59,P=0.036)和患者年齡(0R=0.92,P=0.001)獨立與SVR相關(guān)；而治療開始后,患者年齡(0R=0.88,P=0.001)和RVR(OR=17.24, P=0.012)與SVR獨立相關(guān)。10.本研究建立了IL28B rs8099917基因分型方法即T-ARMS-PCR法,應(yīng)用該方法對56例HCV 1b亞型慢性丙型肝炎患者的rs8099917基因分型結(jié)果與直接測序較為一致,特異性為(98.2%)。T-ARMS-PCR法是一種快速、簡單、有效的rs8099917基因分型方法。11.56例1b亞型慢性丙型肝炎患者中,rs8099917位點的TT基因型的比例為80.4%(45/56),TG基因型的比例為19.6%(11/56),未檢測到GG基因型。攜帶TT基因型患者獲得病毒學(xué)應(yīng)答率顯著高于攜帶TG基因型患者(68.9%vs.27.3%,p=0.029)。測序結(jié)果表明,rs12979860與rs8099917位點基因型有高度的關(guān)聯(lián)性。12.本研究構(gòu)建了6a/JFH1重組病毒質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞后,復(fù)制效力較低,需進一步改造,篩選適應(yīng)性突變病毒株。結(jié)論1.華南地區(qū)慢性丙型肝炎患者中存在8種不同HCV基因亞型：1a、1b、2a、 2b、3a、3b、6a和6d。該地區(qū)主要流行的HCV基因型是1b亞型,其次為6a亞型。華南地區(qū)HCV基因型的流行模式呈現(xiàn)新特點：與輸血或血制品途徑相關(guān)的lb亞型患者比例有減少趨勢,而與靜脈吸毒途徑相關(guān)的6a亞型患者比例有增多趨勢。2.1b和6a亞型兩組慢性丙型肝炎患者治療前臨床基線特征相似,但兩組患者的抗病毒治療結(jié)局不同：與1b亞型相比較,6a亞型患者能夠獲得有較高的SVR率。在抗病毒治療前,HCV基因型是預(yù)測SVR的主要因素；而抗病毒治療開始后,RVR是預(yù)測SVR的主要因素。3.四引物擴增受阻突變體系聚合酶鏈反應(yīng)方法(T-ARMS-PCR)是一種快速、簡單、有效的IL28B rs8099917基因分型方法。攜帶rs8099917 TT基因型患者比TG基因型患者有較高病毒性應(yīng)答率。我國慢性丙型肝炎患者人群中rs8099917與rs12979860位點高度關(guān)聯(lián)。4.本研究成功構(gòu)建了6a/JFH1重組病毒質(zhì)粒,為構(gòu)建6a亞型全基因組細(xì)胞培養(yǎng)體系奠定了實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R512.63

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