【摘要】：乙型肝炎是世界性的流行性疾病,在全球每年至少導致了一百萬人的死亡,也是影響我國人民健康最大的問題之一。乙肝病毒感染是導致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要因素之一。本研究致力于慢性乙型肝炎過程中乙肝病毒感染與一種重要的炎癥基因白細胞介素-32(白介素-32,IL-32)的相互關(guān)系的探討,旨在闡明IL-32被病毒誘導表達的調(diào)控機制,并探明這一炎癥因子在病毒感染過程中發(fā)揮的作用。 IL-32曾經(jīng)被命名為自然殺傷細胞轉(zhuǎn)錄本4(NK4),最近有報道認為它是一種重要的炎癥因子。它主要由免疫細胞表達,在一些病變的炎癥組織中也有表達。為了確定該炎癥因子在乙型肝炎中是否發(fā)揮作用,我們首先檢測了它在177例慢性乙型肝炎病人和40例健康人血清中的含量。數(shù)據(jù)顯示IL-32在病人血清中的含量顯著性地高于正常人。于是我們開展了進一步的檢測,分析確定慢性乙型肝炎病人血清中高水平的IL-32由何種細胞和組織表達產(chǎn)生的。肝臟細胞是乙肝病毒主要的宿主細胞,同時也有大量的報道表明人外周血單個核細胞(PBMC)也可以被乙肝病毒低水平的感染.因此我們檢測了IL-32在這兩種組織細胞中的表達水平。肝臟組織切片的免疫組織化學檢測顯示,慢性乙型肝炎的肝組織切片(n=16)中的IL-32水平明顯高于正常人肝組織切片(n=16)。針對PBMC的熒光定量PCR結(jié)果顯示,慢性乙型肝炎病人PBMC (n=17)中IL-32的mRNA水平顯著性地高于正常人(n=10)。在肝癌細胞系和免疫細胞系中,我們轉(zhuǎn)染乙肝病毒表達質(zhì)粒pHBV-1.3同樣可以誘導IL-32mRNA和蛋白的表達水平。這說明在乙肝病毒慢性感染者體內(nèi),肝細胞和PBMC中的IL-32都被病毒感染激活表達,并且存在分泌型的IL-32γ的表達,這使得血清中的IL-32水平顯著升高。 為了研究乙肝病毒誘導IL-32表達轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子生物學機制,我們首先利用P-mach軟件對該基因的啟動子進行分析,結(jié)果顯示在750bp的核心啟動子區(qū)域內(nèi),存在多個順式作用元件,包括三個NF-κB和一個CREB結(jié)合位點。我們構(gòu)建了核心啟動子的報告基因質(zhì)粒,并針對以上位點對IL-32啟動子進行截短和突變。將這些報告質(zhì)粒和pHBV-1.3或空載體共轉(zhuǎn)染,通過報告基因螢光素酶活性檢測分析顯示,乙肝病毒重要通過激活I(lǐng)L-32啟動子NF-κB位點,從而誘導轉(zhuǎn)錄。NF-KB通路特異性的抑制劑BAY-11實驗也表明該通路被抑制時,乙肝病毒誘導的內(nèi)源性的IL-32的表達大部分被抑制。染色體免疫共沉淀(CHIP)實驗結(jié)果顯示,乙肝病毒極大地促進了轉(zhuǎn)錄因子P65在NF-κB位點的結(jié)合。因此,在轉(zhuǎn)錄水平乙肝病毒主要通過激活NF-KB通路誘導IL-32表達。 我們克隆了IL-32的3’非翻譯區(qū)(UTR)并構(gòu)建到含有報告基因的克隆載體上,與pHBV-1.3共轉(zhuǎn)染后,我們發(fā)現(xiàn)乙肝病毒能上調(diào)該UTR的活性。這暗示在乙肝病毒對IL-32表達的翻譯水平具有正向調(diào)控作用。最近報道,細小RNA (microRNA, miRNA)能通過結(jié)合基因mRNA的3'UTR來調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性和翻譯活性,是細胞內(nèi)重要的翻譯水平調(diào)控因子。我們利用miRNA結(jié)合預測軟件進行分析,預測出20多種miRNA可能結(jié)合在該UTR上。根據(jù)我們已開展的乙肝病毒感染細胞系的miRNA表達芯片篩選結(jié)果,并參考以前報道的乙型肝炎中miRNA表達的臨床數(shù)據(jù),我們從這20多種(?)niRNA中找到了4個與乙肝病毒感染相關(guān),它們分別是miR-29a, miR-29b, miR-29c, miR-223隨后,我們從公司購買了這四種人工合成的成熟的miRNA以及它們對應的抑制子(互補的miRNA),然后將它們與IL-323'-UTR報告質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)染。熒光素酶檢測分析結(jié)果顯示,在四種miRNA中只有miR-29b能顯著地抑制IL-323'UTR活性,并且在四種抑制子中唯有miR-29b能增強IL-323'UTR活性。為了進一步確認miR-29b對IL-32表達的調(diào)控作用,我們轉(zhuǎn)染miR-29b和它的抑制子,然后檢測IL-32的表達。結(jié)果顯示,(?)niR-29b不僅能影響IL-323'UTR活性,而且參與了調(diào)控細胞內(nèi)源性IL-32的表達。之后,為了確認miR-29b在IL-323'UTR上的結(jié)合位點,我們將構(gòu)建好的報告質(zhì)粒依照軟件軟件預測的結(jié)合位點進行了定點突變。結(jié)果顯示突變后的UTR活性不受miR-29b和它的抑制子的影響,從而證實了軟件預測的結(jié)合位點。最后我們在細胞系和病人臨床樣本中檢測了miR-29b在乙肝病毒感染時的表達水平。結(jié)果顯示,無論是在細胞系中還是在病人的PBMC中,乙肝病毒感染均可抑制這—miRNA水平。為了研究在體內(nèi)乙肝病毒感染時(?)miR-29b對IL-32表達的調(diào)控關(guān)系,我們對17份慢性乙肝病人PBMC樣本和8份乙肝病毒感染的肝臟組織樣本中的miR-29b和IL-32水平做相關(guān)性分析,結(jié)果顯示兩種RNA水平在PBMC和肝組織樣本中均存在顯著的負相關(guān)性。因此,研究者認為乙肝病毒通過抑制miR-29b水平從而促進IL-32的翻譯,這是對這一炎癥基因表達調(diào)控機制的重要補充。 IL-32在乙型肝炎中發(fā)揮的作用,尤其是對病毒感染和復制的影響是該研究工作的另一重要部分。鑒于報道在IL-32六種間接異構(gòu)體中γ亞型具有最好的活性,我們在乙肝病毒表達細胞系HepG2.2.15中采用IL-32γ開展抗病毒實驗。但是結(jié)果顯示無論是IL-32γ轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒還是添加人源重組蛋白,乙肝病毒DNA和蛋白抗原表達水平都無顯著性改變。由于乙型肝炎病人血清中IL-32高水平的存在,啟發(fā)了研究者采用模擬體內(nèi)真實環(huán)境的模型開展抗病毒實驗。我們首先從正常人和肝炎病人血液中分離PBMC并進行體外培養(yǎng),然后用重組IL-32γ蛋白進行刺激,利用收集的細胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)HepG2.2.15.結(jié)果顯示乙肝病毒的復制和表達被這種上清液顯著地抑制。此外,這種細胞培養(yǎng)上清液對艾滋病毒、腸道病毒-71和丙肝病毒的復制有顯著性的抑制作用。研究者認為這種具有廣譜抗病毒作用的細胞培養(yǎng)上清中存在著有效抗病毒作用的分子�；冖裥秃廷笮透蓴_素(IFN)是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的抗病毒因子,我們開展了這兩種IFN的抗體中和實驗。結(jié)果顯示,IFN-λ1抗體中和的上清液的抗病毒效果完全消失。這暗示重組IL-32γ蛋白在PBMC培養(yǎng)體系中導致了大量IFN-λ1的表達并分泌到上清液中從而使其具有抗病毒作用。針對IFNs的熒光定量PCR實驗證實了IL-32γ能在PBMC中誘導IFN-λ1的表達,而IFN-α和IFN-β的表達量沒有顯著性的改變。深入的研究發(fā)現(xiàn)IL-32γ能通過激活I(lǐng)FN-λ1啟動子遠端的一串獨特的NF-κB位點簇從而選擇性地大量誘導這一抗病毒因子的表達。因此,我們認為血清中的IL-32γ通過在PBMC中特異性地誘導IFN-λ1的表達從而發(fā)揮抗病毒作用,這也闡明了IL-32抗病毒的途徑和機制。 我們用研究IL-32同樣的方法研究了IFN-λ1的3'UTR,篩選出并證明了miR-548能結(jié)合IFN-λ1mRNA3'UTR,從而調(diào)控基因表達。并且miR-548/抑制子能通過調(diào)控IFN-λ1的表達影響細胞內(nèi)天然免疫反應。同時我們發(fā)現(xiàn),病毒感染時(?)niR-548表達水平是被抑制的。這是對病毒感染誘導IFN-γ1及其介導的抗病毒反應機制的重要補充。
[Abstract]:Hepatitis B is a worldwide epidemic disease, which causes at least one million deaths worldwide every year. It is also one of the biggest problems affecting the health of our people. Hepatitis B virus infection is one of the important factors leading to chronic hepatitis, cirrhosis and liver cancer. The purpose of this study is to elucidate the regulatory mechanism of IL-32 expression induced by viruses and to explore the role of IL-32 in viral infection.
IL-32, once named natural killer cell transcript 4 (NK4), has recently been reported to be an important inflammatory factor. It is mainly expressed in immune cells and in inflammatory tissues of some lesions. Serum levels of IL-32 in patients with hepatitis and 40 healthy controls were significantly higher than those in normal controls. Further tests were carried out to determine which cells and tissues were responsible for the production of high levels of IL-32 in the serum of patients with chronic hepatitis B. Hepatocytes were the predominant hepatitis B virus. There are also numerous reports that human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) can also be infected with low levels of hepatitis B virus. Therefore, we examined the expression of IL-32 in these two tissues and cells. Immunohistochemical examination of liver tissue sections showed that IL-32 in liver tissue sections of chronic hepatitis B (n=16) was water. The level of IL-32 mRNA in PBMC (n=17) of patients with chronic hepatitis B was significantly higher than that in normal controls (n=10). In hepatocellular carcinoma cell lines and immune cell lines, the expression plasmid pHBV-1.3 could also induce IL-32 mRNA and protein. This indicates that both hepatocytes and IL-32 in PBMC are activated by hepatitis B virus infection and secretory IL-32 gamma is expressed, which makes the level of IL-32 in serum increase significantly.
To study the molecular biological mechanism of transcriptional regulation of hepatitis B virus-induced IL-32 expression, we first analyzed the promoter of the gene using P-mach software. The results showed that there were several cis-acting elements in the 750 BP core promoter region, including three NF-kappa B and one CREB binding site. These reporter plasmids were co-transfected with pHBV-1.3 or empty vector, and the luciferase activity assay showed that hepatitis B virus could induce transcription by activating the NF-kappa B site of IL-32 promoter. The BAY-11 experiment also showed that the endogenous IL-32 expression induced by hepatitis B virus was mostly inhibited when the pathway was inhibited. Chromosome immunoprecipitation (CHIP) assay showed that hepatitis B virus greatly promoted the binding of transcription factor P65 at the NF-kappa B site. Therefore, hepatitis B virus induced IL mainly by activating the NF-KB pathway at the transcriptional level. -32 expression.
We cloned the 3'untranslated region (UTR) of IL-32 and constructed a vector containing reporter gene. After co-transfection with pHBV-1.3, we found that hepatitis B virus could up-regulate the activity of UTR. This suggests that hepatitis B virus has a positive regulatory effect on the translation level of IL-32 expression. The 3'UTR of gene mRNA regulates the stability and translation activity of mRNA, which is an important intracellular translation level regulator. We used the microRNA binding prediction software to analyze and predict that more than 20 kinds of microRNAs may bind to the UTR. Based on the microarray screening results of hepatitis B virus-infected cell lines, we also referred to the previous reports. Four of the more than 20 kinds of (?) niRNA were found to be associated with hepatitis B virus infection. They were microRNAs - 29a, microRNAs - 29b, microRNAs - 29c, and microRNAs - 223. We co-transfected with IL-323'-UTR reporter plasmid. Luciferase assay showed that only microRNAs-29b significantly inhibited IL-323'UTR activity in the four microRNAs, and only microRNAs-29b enhanced IL-323' UTR activity in the four inhibitors. In order to further confirm the regulatory effect of microRNAs-29b on IL-32 expression, we transfected microRNAs-29b and its expression. The results showed that (?) niR-29b not only affected the activity of IL-323'UTR, but also regulated the expression of endogenous IL-32 in cells. The results showed that the UTR activity of the mutant was not affected by the microRNAs-29b and its inhibitors, thus confirming the binding sites predicted by the software. Finally, we detected the expression of microRNAs-29b in hepatitis B virus infection in cell lines and patient clinical samples. In order to study the relationship between the expression of IL-32 and microRNAs-29b during hepatitis B virus infection in vivo, we analyzed the correlation between the levels of microRNAs-29b and IL-32 in 17 PBMC samples from patients with chronic hepatitis B and 8 liver samples from patients with hepatitis B virus infection. Therefore, researchers believe that hepatitis B virus promotes the translation of IL-32 by inhibiting the level of microRNAs-29b, which is an important complement to the regulation mechanism of this inflammatory gene expression.
The role of IL-32 in hepatitis B, especially in viral infection and replication, is another important part of this study. In view of the reported activity of the six indirect isoforms of IL-32, we used IL-32 gamma to carry out antiviral experiments in the hepatitis B virus expression cell line HepG2.2.15. There was no significant change in the expression of HBV DNA and protein antigens, whether IL-32gamma was transfected or human recombinant protein was added. The presence of high levels of IL-32 in the serum of patients with hepatitis B inspired researchers to carry out antiviral experiments using a model simulating the real environment in vivo. HepG2.2.15 was cultured with the collected cell culture supernatant. The results showed that the replication and expression of hepatitis B virus were significantly inhibited by the supernatant. In addition, the cell culture supernatant of HIV, enterovirus-71 and hepatitis C was stimulated by recombinant IL-32 gamma protein. Researchers believe that there are effective antiviral molecules in the supernatant of this broad-spectrum antiviral cell culture. Based on the type I and type III interferon (IFN) which is the most effective antiviral factor found so far, we have carried out antibody neutralization experiments for both IFN. The antiviral effect of the supernatant neutralized by antibody to lambda-1 disappeared completely, suggesting that the recombinant IL-32gamma protein resulted in the expression of a large number of IFN-lambda-1 in the PBMC culture system and secreted into the supernatant, thus making it have antiviral effect. The fluorescence quantitative PCR assay for IFNs confirmed that IL-32gamma could induce the expression of IFN-lambda-1 in PBMC, while IFN-alpha and IFN-lambda- In-depth studies have shown that IL-32gamma can selectively induce the expression of this antiviral factor by activating a unique cluster of NF-kappa B sites at the distal end of the IFN-lambda 1 promoter. Antiviral effect, which also elucidates the pathway and mechanism of IL-32 antiviral.
We studied the 3'UTR of IFN-lambda 1 in the same way as IL-32. We screened and demonstrated that microRNAs-548 could bind to IFN-lambda 1 mRNA 3'UTR to regulate gene expression. This is an important complement to the mechanism of viral infection inducing IFN- gamma 1 and its mediated antiviral response.
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62

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本文編號：2177082