發(fā)布時(shí)間：2018-07-17 20:41

【摘要】：腸道新發(fā)原蟲病是全球面臨的重要公共衛(wèi)生問題,也是人類迄今為止面臨的最困難的問題之一,可暴發(fā)流行,造成嚴(yán)重的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。其中,隱孢子蟲、賈第蟲、微孢子蟲和環(huán)孢子蟲感染分別引起以腹痛、急性或自限性腹瀉和營(yíng)養(yǎng)不良為主要癥狀的隱孢子蟲病、賈第蟲病、微孢子蟲病和環(huán)孢子蟲病,是近年來被高度關(guān)注的人獸共患腸道原蟲,也是重要的機(jī)會(huì)致病原蟲,在嬰幼兒和免疫功能受損或缺陷者易感并可引起嚴(yán)重的腹瀉,乃至死亡。隱孢子蟲病被WHO列為世界六大腹瀉病之一；隱孢子蟲病和環(huán)孢子蟲病列入美國(guó)FoodNet食源性監(jiān)測(cè)疾��；隱孢子蟲和賈第蟲是我國(guó)生活飲用水必檢指標(biāo)。這些原蟲可感染人和多種動(dòng)物,主要經(jīng)糞-口途徑直接接觸或食入卵囊或包囊污染的食物或水而傳播,腹瀉患者、免疫功能受損或缺陷者隱孢子蟲等原蟲的感染率較高。本研究以腹瀉患者、HIV/AIDS患者以及可能與人關(guān)系密切的寵物和觀賞動(dòng)物為研究對(duì)象,進(jìn)行新發(fā)腸道原蟲病病原檢測(cè)和分子鑒定,并對(duì)獲得的安氏隱孢子蟲和畢氏微孢子蟲進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)研究,對(duì)于研究新蟲種、新基因型、疾病傳播、病原溯源及臨床診斷和治療都有著重要的意義。此外,鑒于上述四種原蟲的重要性,本研究還首次建立了能同時(shí)檢測(cè)四種腸道原蟲的多重PCR方法。主要研究結(jié)果如下：1.臨床腹瀉患者隱孢子蟲、賈第蟲和微孢子蟲感染及基因型特征分析：上海市浦東新區(qū)某醫(yī)院252例臨床腹瀉患者中,腸道原蟲檢測(cè)總陽性率為30.16%(76/252),隱孢子蟲和微孢子蟲的陽性率均為13.49%(34/252),賈第蟲陽性率為6.75%(17/252),未發(fā)現(xiàn)環(huán)孢子蟲感染。其中有8例患者同時(shí)感染隱孢子蟲和微孢子蟲,1例患者同時(shí)感染隱孢子蟲和賈第蟲。進(jìn)一步基因分型發(fā)現(xiàn),所有隱孢子蟲陽性樣本均為安氏隱孢子蟲,所有微孢子蟲均為畢氏微孢子蟲；賈第蟲陽性樣本中,除1份為集聚體B外,其余16份均為集聚體C。同時(shí)發(fā)現(xiàn),冬季樣本隱孢子蟲和微孢子蟲檢測(cè)陽性率較春季高,而這三種原蟲感染患者在年齡和性別上未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該研究首次發(fā)現(xiàn)安氏隱孢子蟲在人群的流行,及賈第蟲聚集體C可感染人。本研究首次提出安氏隱孢子蟲是繼人隱孢子蟲、微小隱孢子蟲和火雞隱孢子之外的第四種感染人的優(yōu)勢(shì)蟲種；賈第蟲集聚體C是繼聚集體A和B之外的又一種人獸共患新的基因型；揭示了安氏隱孢子蟲和賈第蟲聚集體C的公共衛(wèi)生危害。2. HIV/ADDS患者隱孢子蟲、賈第蟲和微孢子蟲感染及基因型特征分析：對(duì)285份廣西地區(qū)的HIV/AIDS患者糞便檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在多種腸道原蟲感染。鑒定出兩例隱孢子蟲,核苷酸測(cè)序分析表明1例為安氏隱孢子蟲,1例為人隱孢子蟲,gp60亞型分析為I bA19G2亞型。賈第蟲的陽性率為2.81%(8/285),其中,7份賈第蟲陽性樣本為集聚體B,1份為集聚體C。微孢子蟲陽性率為11.58%(33/285),經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)3個(gè)新基因型,分別命名為GX25(1例)、GX456(1例)和GX458(1例),其余陽性樣本屬于4個(gè)基因型：PigEBITS7(7例)、TypeⅣ/K(8例)、D(11例)、EbpC(4例),進(jìn)化樹分析表明所有的微孢子蟲樣本同處于進(jìn)化樹中的Groupl。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)來自農(nóng)村患者感染微孢子蟲陽性率明顯高于其他職業(yè)者,飲用生水為主者微孢子蟲陽性率明顯高于其他類型飲水者,揭示該地區(qū)微孢子蟲的感染與患者的衛(wèi)生及飲水狀況等有密切關(guān)系。3.寵物及觀賞動(dòng)物賈第蟲的感染及基因型特征分析：對(duì)來自上海市某寵物醫(yī)院和某動(dòng)物園的共84份動(dòng)物糞便樣本進(jìn)行賈第蟲的檢測(cè)。結(jié)果顯示,PCR檢測(cè)陽性率為15.48%(13/84),形態(tài)學(xué)檢查陽性率為5.85%(5/84)。PCR檢測(cè)中,谷氨酸脫氫酶(GDH)基因的擴(kuò)增率最高,為92.31%(12/13),其次為β-賈第素(BG)基因和磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)基因則分別為69.23%(9/13)和53.85%(7/13)。序列分析發(fā)現(xiàn)4條新的基因序列,集聚體分析顯示所檢測(cè)樣本中存在4個(gè)集聚體：C、D、E和F,同時(shí)發(fā)現(xiàn)有3份樣本存在集聚體D和C間轉(zhuǎn)換,1份樣本集聚體F和D間轉(zhuǎn)換。結(jié)果表明PCR方法具有較高的敏感性,且不同標(biāo)志基因的擴(kuò)增效率不同,多位點(diǎn)基因分型(MLG)方法比擴(kuò)增單個(gè)基因可降低漏檢率。由于兩條序列在氨基酸水平上與人源賈第蟲基因序列同源性為100%,表明這些賈第蟲在一定程度上存在人獸共患的潛能。4.安氏隱孢子蟲和畢氏微孢子蟲多位點(diǎn)序列分型(MLST):針對(duì)上述安氏隱孢子蟲和畢氏微孢子蟲樣本采用MLST分析,研究其種群遺傳結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示安氏隱孢子蟲樣本MS1和MS3位點(diǎn)的基因型均為A4亞型(牛源),表明該人源安氏隱孢子蟲傳染源可能為牛。本研究還對(duì)5個(gè)位點(diǎn)均擴(kuò)增成功的18個(gè)微孢子蟲樣本樣本進(jìn)行分析,尚未發(fā)現(xiàn)明確的亞群結(jié)構(gòu)區(qū)分。5.隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲多重PCR檢測(cè)方法的建立：鑒于四種腸道新發(fā)原蟲的重要性,本研究首次建立了一種可同時(shí)檢測(cè)隱孢子蟲、賈第蟲、微孢子蟲和環(huán)孢子蟲等四種腸道原蟲的多重PCR方法,國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。能特異檢測(cè)特定病原,最低檢測(cè)拷貝數(shù)可達(dá)10個(gè)/μL,與單病原(單個(gè)基因)擴(kuò)增方法比較,符合率可達(dá)90%。本研究成功建立了多重PCR檢測(cè)四種原蟲的方法,特異性和敏感性較高,穩(wěn)定性較好,能用于臨床和疾控現(xiàn)場(chǎng)樣本多病原的同時(shí)檢測(cè)。
[Abstract]:It is one of the most difficult problems faced by the world . It is also one of the most difficult problems faced by mankind to date , which causes serious public health events .
Food Net Food - borne Surveillance Diseases in the United States ;
The results were as follows : 1 . The positive rate of intestinal protozoan was 30.16 % ( 76 / 252 ) .
The results showed that there were no statistical differences in both age and sex . The results showed that the positive rate of cryptosporosis and microsporozoites in winter samples were higher than that in spring , while those of these three protozoan infected patients had no statistical difference in age and sex .
The Giardia aggregate C is a new type of human animal with the addition of aggregates A and B .
The public health hazards of the conidiospore insect and the Giardia aggregate C are revealed . The results showed that the positive rate was 15.48 % ( 13 / 84 ) , and the positive rate was 92.31 % ( 12 / 13 ) . The multiplex PCR method of four kinds of intestinal protozoans , such as Giardia , Microsporozoites and Cyclospora , has not been reported at home and abroad . It is possible to detect the specific pathogen at home and abroad . The detection copy number can be up to 10 / 渭L , and the coincidence rate can be up to 90 % . This study successfully establishes the methods of multiplex PCR to detect four kinds of protozoan . It has high specificity and sensitivity and good stability . It can be used for simultaneous detection of multiple pathogens in clinical and disease control field samples .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R440;R531

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本文編號(hào)：2130874