本文選題：HIV-1 + 耐藥突變　； 參考：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：在人類與艾滋病30多年抗?fàn)幍臍v程中,抗HIV-1藥物的研發(fā)和應(yīng)用是取得的最大成就之一。1996年首次將不同種類的藥物聯(lián)合應(yīng)用,建立了高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART),能夠把HIV-1復(fù)制抑制到現(xiàn)有方法檢測(cè)不到的水平,大幅度降低了病死率,提高了生存質(zhì)量�；诳共《局委熞约皽p少HIV-1傳播的巨大成功,近幾年國(guó)際上把擴(kuò)大治療和預(yù)防性治療作為艾滋病預(yù)防控制的新型策略,提倡早治療和對(duì)處于感染危險(xiǎn)之下的人暴露前/后預(yù)防用藥。截至2015年6月,全世界已有約1600萬(wàn)人接受過(guò)艾滋病抗病毒治療。因此,與20年前不同的是,目前HIV-1是在普遍存在的藥物壓力下傳播和進(jìn)化的。HIV-1具有高度的變異性和極快的復(fù)制速率,易在藥物選擇壓力下快速產(chǎn)生耐藥性。目前對(duì)所有種類的抗HIV-1藥物均已報(bào)道了耐藥毒株,這將導(dǎo)致藥物失效和治療失敗。因此,研發(fā)對(duì)耐藥病毒株有效的新型抗HIV-1藥物仍然是艾滋病預(yù)防控制的迫切需要。臨床前藥效學(xué)研究是抗HIV-1新藥研發(fā)的基礎(chǔ),對(duì)耐藥HIV-1毒株抑制活性的評(píng)價(jià)是新藥臨床前藥效學(xué)研究的重要內(nèi)容。美國(guó)FDA抗HIV-1藥物藥效學(xué)研究指南建議,將耐藥性研究作為抗病毒藥物藥效學(xué)研究的重點(diǎn)。相對(duì)于野生型毒株抑制活性的評(píng)價(jià),對(duì)耐藥毒株的藥效學(xué)研究面臨許多特殊問(wèn)題:(1)我國(guó)既往對(duì)HIV-1耐藥的研究主要是基因型檢測(cè)和分析,尚不具備標(biāo)準(zhǔn)化的表型耐藥檢測(cè)方法以及不了解流行毒株的表型耐藥特征。(2)由于已經(jīng)在臨床上使用的抗HIV-1藥物種類較多,病人往往攜帶多種多個(gè)耐藥突變,不同突變對(duì)藥效的影響不同并難以評(píng)估。(3)常規(guī)使用的評(píng)估指標(biāo)(IC50及其與野生毒株相比提高的倍數(shù))難以準(zhǔn)確評(píng)估蛋白酶抑制劑(PIs)和多數(shù)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)耐藥毒株的藥效改變。針對(duì)這些問(wèn)題,本研究首先建立了基于重組病毒的HIV-1表型耐藥檢測(cè)方法,了解我國(guó)主要流行毒株對(duì)常用藥物的表型耐藥情況。然后借此方法評(píng)估了常用抗病毒藥物對(duì)攜帶多種耐藥突變和突變型的HIV-1毒株的抑制活性,提出了一個(gè)新的評(píng)價(jià)參數(shù)。根據(jù)對(duì)HIV-1復(fù)制和抗HIV-1藥物抑制活性的了解,采用所建立的表型耐藥檢測(cè)方法及其他研究方法,利用所建立的評(píng)價(jià)參數(shù),對(duì)設(shè)計(jì)的兩個(gè)新型抗HIV-1候選藥物(新型蛋白酶抑制劑和針對(duì)Vpu-tetherin相互作用的多肽)進(jìn)行了臨床前抗病毒活性研究,尤其是臨床前耐藥性相關(guān)研究,并初步探討了可能的作用機(jī)制。第一章基于重組病毒的HIV-1表型耐藥檢測(cè)方法的建立及我國(guó)流行毒株表型耐藥特征的研究目前常用的HIV-1耐藥檢測(cè)方法有基因型和表型兩種�；蛐湍退帣z測(cè)方法由于快速且價(jià)格低廉,被廣泛開(kāi)展。表型耐藥檢測(cè)方法由于對(duì)實(shí)驗(yàn)室和技術(shù)要求較高開(kāi)展較少,但是該方法在耐藥位點(diǎn)鑒定以及新型抗HIV-1藥物的活性研究等方面是必須的。我國(guó)HIV-1毒株流行呈現(xiàn)復(fù)雜的多樣性,目前對(duì)HIV-1毒株基因型耐藥的研究較多,但缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的表型耐藥檢測(cè)方法,對(duì)流行毒株的表型耐藥特征亦不了解。本章的目的是建立一種基于重組病毒的HIV-1表型耐藥檢測(cè)方法,并借此了解我國(guó)主要流行毒株對(duì)常用抗HIV-1藥物的表型耐藥性,從而對(duì)以基因型為基礎(chǔ)的耐藥毒株監(jiān)測(cè)結(jié)果提供補(bǔ)充,為制定藥物使用策略以及臨床合理用藥提供依據(jù)。方法與結(jié)果:(1)采集全國(guó)10個(gè)省市的28例艾滋病患者的血漿標(biāo)本,收集臨床和流行病學(xué)信息。提取純化病毒RNA,巢式RT-PCR擴(kuò)增獲得gag-pol目的片段,包含編碼蛋白酶的全部密碼子(1-99個(gè))以及逆轉(zhuǎn)錄酶的前312個(gè)密碼子。目的片段測(cè)序后編輯整理,提交至美國(guó)斯坦福大學(xué)HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù),得到基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果,系統(tǒng)進(jìn)化分析得到病毒的基因亞型。病毒的基因型包含B、CRF01_AE和CRF07_BC,僅2例存在耐藥突變,其余無(wú)任何耐藥相關(guān)突變。(2)以野生型p NL4.3質(zhì)粒為骨架,將來(lái)自病人的gag-pol目的片段克隆至p NL4.3-Δ(Sph I-Age I)上,構(gòu)建重組感染性克隆,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,獲得19株具有穩(wěn)定復(fù)制能力的重組病毒。利用MT2/TZM-bl細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng),在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)重組病毒對(duì)6種目前常用一線抗HIV-1藥物(AZT/3TC/d4T/dd I/NVP/EFV)的表型耐藥性,重復(fù)3次,獲得114組表型耐藥檢測(cè)數(shù)據(jù)。(3)將基因型和表型耐藥檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析�；蛐团c表型耐藥檢測(cè)結(jié)果的一致率為96.5%。1例接受過(guò)治療的河南患者(HN2009001)攜帶M41L\L210W\T215Y\K103N\K238T耐藥突變,對(duì)6種藥物均表現(xiàn)為耐藥,IC50提高3.92-126.75倍,說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。14例未檢出任何耐藥基因突變的患者對(duì)6種藥物均敏感,另有4例未檢出任何耐藥基因突變的病人,對(duì)NVP或EFV的IC50提高3.41-7.84倍。小結(jié):建立了一種基于重組病毒的HIV-1表型耐藥檢測(cè)和研究方法,多數(shù)表型與基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果一致,可以對(duì)HIV-1的表型耐藥水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量評(píng)估,為研究HIV-1的耐藥性以及新型抗HIV-1藥物的臨床前藥效學(xué)奠定了方法基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)了基因型無(wú)耐藥突變但表型顯示中低度耐藥的病例,提示存在其他導(dǎo)致耐藥的因素,值得深入研究。第二章主要HIV-1耐藥突變及突變型對(duì)藥效的影響及新型評(píng)價(jià)參數(shù)的建立評(píng)估藥物對(duì)HIV-1耐藥毒株的抑制活性,目前使用的指標(biāo)是藥物對(duì)病毒50%抑制活性(IC50)及其相對(duì)于野生毒株提高的倍數(shù)。制定這個(gè)指標(biāo)的前提是假設(shè)耐藥突變僅導(dǎo)致劑量反應(yīng)曲線向右平移,對(duì)曲線的形狀沒(méi)有影響。而實(shí)際上耐藥突變對(duì)藥效可產(chǎn)生全面的影響,不僅IC50提高,劑量反應(yīng)曲線的斜率也會(huì)發(fā)生變化,甚至只有斜率的下降。而目前攜帶各類耐藥突變或突變型的病毒對(duì)各類抗HIV-1藥物藥效的影響還不清楚,使用的指標(biāo)也難以準(zhǔn)確評(píng)估對(duì)各類藥物的表型耐藥性。本章的目的是借助第一章所建立的HIV-1表型耐藥檢測(cè)方法,闡明主要耐藥突變或突變型對(duì)各類抗HIV-1藥物的藥效影響,提出新的考慮了IC50和斜率的評(píng)價(jià)參數(shù)。方法與結(jié)果:(1)以野生型p NL4.3質(zhì)粒為骨架,定點(diǎn)突變構(gòu)建重組感染性克隆質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染獲得8株能穩(wěn)定復(fù)制的攜帶不同耐藥突變的重組病毒。(2)在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定已上市的10種抗HIV-1藥物對(duì)重組病毒的抑制活性,繪制劑量反應(yīng)曲線,重復(fù)3次。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室之前已有的數(shù)據(jù),共獲得22個(gè)耐藥毒株對(duì)10種抗HIV-1藥物的藥效學(xué)數(shù)據(jù)。(3)概括每種突變毒株對(duì)各種抗HIV-1藥物的藥效學(xué)特征。發(fā)現(xiàn)各類耐藥突變對(duì)不同藥物的藥效學(xué)參數(shù)影響不同,有三種情況:(1)僅影響IC50,對(duì)斜率無(wú)任何影響。多數(shù)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs)耐藥突變屬于這種情況;(2)對(duì)IC50和斜率均產(chǎn)生影響。例如攜帶K103N\H221Y\Y181C\T215Y突變的重組病毒使得EFV的IC50增加13.36倍,同時(shí)斜率下降為原來(lái)的一半;(3)僅改變劑量反應(yīng)曲線的斜率而對(duì)IC50無(wú)影響。在非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)和蛋白酶抑制劑(PIs)耐藥毒株中這種情況較為多見(jiàn)。例如,攜帶G48V\I54V突變的重組病毒不影響RTV的IC50但降低斜率,攜帶V82A突變的重組病毒株使SQV的斜率降為野生毒株的0.41,但I(xiàn)C50無(wú)變化。(4)綜合考慮IC50和斜率,并納入臨床前研究可獲得的最大無(wú)毒濃度等數(shù)據(jù),首次提出新的藥效學(xué)評(píng)價(jià)參數(shù)IIP atoxic,所有藥物的IIP atoxic均與文獻(xiàn)報(bào)道的納入臨床最大血藥濃度的參數(shù)IIP max具有良好的相關(guān)性(r0.95,P0.001)。小結(jié):闡明了常見(jiàn)和主要的HIV-1耐藥突變和突變型對(duì)10種抗HIV-1藥物的藥效學(xué)特征,發(fā)現(xiàn)不同類型的耐藥突變或突變型對(duì)IC50和/或斜率有不同的影響,PIs和NNRTIs耐藥突變對(duì)劑量反應(yīng)曲線的斜率影響最為明顯。首次提出了新的綜合考慮IC50和斜率的可用于臨床前藥效學(xué)研究的評(píng)價(jià)參數(shù)IIP atoxic,可在沒(méi)有藥代學(xué)數(shù)據(jù)時(shí)評(píng)估對(duì)耐藥毒株的抑制活性,為針對(duì)耐藥毒株的臨床前藥效學(xué)研究提供了全面準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)參數(shù)。第三章新型蛋白酶抑制劑DG35的抗HIV-1活性研究我國(guó)目前還沒(méi)有一種在臨床應(yīng)用的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗HIV-1藥物。DG35是我國(guó)自主研發(fā)的以HIV-1蛋白酶為靶標(biāo)的小分子化合物,對(duì)其抗HIV-1活性還不清楚。本章旨在評(píng)估DG35的臨床前抗HIV-1活性,為該藥的后續(xù)研發(fā)提供臨床前藥效學(xué)數(shù)據(jù)。方法與結(jié)果:按照FDA推薦的抗HIV-1藥物臨床前藥效學(xué)研究?jī)?nèi)容,采用之前建立的HIV-1表型耐藥研究方法及構(gòu)建的病毒株,利用所建立的評(píng)價(jià)參數(shù),采用高通量篩選和評(píng)價(jià)方法,分別從細(xì)胞毒性、對(duì)不同基因背景的病毒株的抑制活性、藥物聯(lián)合配伍效果以及加壓誘導(dǎo)耐藥毒株等幾個(gè)方面,對(duì)DG35進(jìn)行全面的臨床前活性研究,尤其是臨床前耐藥性研究。研究發(fā)現(xiàn):(1)DG35在本實(shí)驗(yàn)條件下具有肯定的抗HIV-1的活性,且對(duì)野生型參考病毒株(HIV-1NL4.3)的IC50(3.58±0.10n M)低于已在臨床應(yīng)用的IDV(7.19±1.01n M),斜率(3.42±0.58)高于IDV(2.49±0.23)。(2)DG35對(duì)攜帶M46I、I54V、V82A、M46I\N88S和M46I\V82T\I84V耐藥突變病毒株的抑制活性與野生型參考病毒株的抑制活性相當(dāng)(1.02-12.46n M)。與HIV-1NL4.3相比,攜帶蛋白酶抑制劑耐藥突變(G48V\I54V)的毒株對(duì)DG35不僅IC50提高了65.57倍,且劑量反應(yīng)曲線的斜率也發(fā)生變化,其IIP atoxic值亦下降。而DG35對(duì)3株NNRTIs耐藥毒株具有良好的抑制活性。(3)DG35與AZT(NRTI)、EFV(NNRTI)和RTV(PI)均有高度的協(xié)同抗HIV-1作用,協(xié)同指數(shù)分別為592.28n M2%、661.33n M2%和528.72n M2%。(4)體外藥物加壓誘導(dǎo)培養(yǎng),連續(xù)傳6代,未誘導(dǎo)出DG35的耐藥毒株。小結(jié):DG35對(duì)實(shí)驗(yàn)室傳代毒株具有較強(qiáng)的抑制活性,對(duì)于常見(jiàn)的PIs耐藥毒株也有一定的抑制活性,但對(duì)攜帶G48V\I54V和G48V\I54V\V82A突變的蛋白酶抑制劑耐藥毒株的活性有所下降,與NNRTIs無(wú)交叉耐藥性。與目前臨床使用的三種抗HIV-1藥物具有高度協(xié)同作用,同時(shí)具有較高的耐藥基因屏障。這些結(jié)果為該藥的后續(xù)研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。第四章以Vpu-tetherin相互作用為靶標(biāo)的抗HIV-1多肽的設(shè)計(jì)和活性研究HIV-1幾乎對(duì)于目前已上市的所有藥物均出現(xiàn)了耐藥性,需要研究針對(duì)新靶點(diǎn)的藥物。Tetherin(THN)是宿主細(xì)胞表面的蛋白,可以將HIV-1粘附到細(xì)胞表面阻斷其出芽復(fù)制,是人體細(xì)胞天然的抗病毒機(jī)制。HIV-1在進(jìn)化過(guò)程中獲得了Vpu,利用細(xì)胞內(nèi)蛋白降解途徑介導(dǎo)tetherin降解,從而對(duì)抗細(xì)胞的天然抗病毒功能。阻斷Vpu對(duì)tetherin的降解作用是有前景的抗HIV-1新靶標(biāo),然而到目前為止,還沒(méi)有報(bào)道任何一種小分子或者多肽可以阻斷Vpu與tetherin的相互作用。本章的目的是設(shè)計(jì)針對(duì)Vpu-tetherin相互作用的抗HIV-1多肽,進(jìn)行活性驗(yàn)證,探討可能的作用機(jī)制,為新靶點(diǎn)藥物研發(fā)提供新的思路。方法與結(jié)果:(1)檢索野生型參考病毒株HIV-1NL4.3Vpu的氨基酸序列,以10個(gè)氨基酸為一個(gè)跨度,設(shè)計(jì)、合成了7條可能競(jìng)爭(zhēng)性阻斷Vpu與tetherin結(jié)合的Vpu多肽類似物。同時(shí)從Vpu多肽中隨機(jī)選擇20個(gè)氨基酸合成2條隨機(jī)多肽,作為對(duì)照。(2)利用前期建立的藥效學(xué)研究方法進(jìn)行抑制活性的確證。獲得了3條具有一定抑制活性的多肽,分別命名為CJ128、CJ130和CJ131,IC50分別為4.29±0.05μM、3.75±0.13μM和3.50±0.21μM,而兩條隨機(jī)多肽對(duì)于HIV-1NL4.3未表現(xiàn)出任何抑制活性。(3)Vpu和tetherin在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá),Western blot實(shí)驗(yàn)表明CJ128和CJ130可以恢復(fù)tetherin的表達(dá)水平,多肽可能通過(guò)阻斷Vpu介導(dǎo)的tetherin的降解以抑制HIV-1的復(fù)制。(4)激光掃描共聚焦顯微成像發(fā)現(xiàn)所有活性多肽確實(shí)結(jié)合于細(xì)胞表面,從而可能與存在于細(xì)胞表面的tetherin結(jié)合而發(fā)揮抑制作用,而對(duì)照多肽則無(wú)此現(xiàn)象。小結(jié):設(shè)計(jì)合成了3條具有潛在抗HIV-1活性的多肽,可抑制Vpu依賴的病毒顆粒的釋放,證實(shí)其定位于細(xì)胞表面,可能與Vpu競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合存在于細(xì)胞表面的tetherin,對(duì)Vpu介導(dǎo)的tetherin的降解產(chǎn)生一定的阻斷作用,以抑制HIV-1的復(fù)制。我們的研究首次證實(shí)競(jìng)爭(zhēng)性阻斷Vpu與tetherin的結(jié)合是抑制HIV-1復(fù)制的有效方式,這為進(jìn)一步基于這個(gè)靶點(diǎn)的藥物研發(fā)提供了基礎(chǔ),具有良好的研究和應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.91

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本文編號(hào)：2068706