本文選題：埃博拉病毒 + 室間質量評價　； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2016年博士論文

【摘要】：2014年西非爆發(fā)的埃博拉出血熱疫情在全世界范圍引起廣泛關注。中國與西非往來密切,疫情爆發(fā)期間,埃博拉病患自境外輸入中國的風險較高且持續(xù)存在。提高該病毒的早期準確檢測能力,成為我國防控埃博拉疫情的關鍵。為提高全國范圍,特別是重要港口城市,具備埃博拉病毒檢測資質的實驗室、檢驗檢疫機構等對該病毒的檢測能力,2014年12月衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織開展相關質量評價工作。鑒于埃博拉病毒屬于生物安全四級防控病毒,一旦感染具有極高的致死性,常規(guī)利用滅活病毒或感染病人陽性血清制備質控品的方法不適用于本次質量評價。因此,我們選擇生物安全性高、穩(wěn)定性好、對RNA保護作用強的噬菌體MS2病毒樣顆粒(Bacteriophage MS2 virus-like particles, MS2 VLPs),制備包裹2014年西非流行株扎伊爾型埃博拉病毒核衣殼蛋白(Nucleoprotein, NP) RNA全長、包膜糖蛋白(Glycoprotein, GP)及RNA依賴的RNA聚合酶L(Polymerase)部分RNA序列的重組MS2 VLPs質控品,對各參評機構進行發(fā)放。在19家參評機構回報的20份結果中(其中一家機構回報了NP及GP/L雙靶標檢測結果),14家機構(73.68%)回報完全正確,3家機構(15.79%)出現一個假陰性結果,1家(5.26%)出現兩個假陰性結果,剩余1家機構(5.26%)回報錯誤結果超過3個。本次質評樣本盤中全部陰性樣本結果回報正確,上述錯誤回報結果主要集中在對弱陽性樣本的檢出方面。針對本次質量評價中存在的假陰性問題,我們提出使用商品化試劑盒或國家CDC提供的標準引物、探針檢測,使用雙靶標檢測方法,以及對操作人員規(guī)范化培訓、及時校準儀器等改進意見。本次質評工作促進了各參評機構埃博拉病毒核酸檢測能力的提高,在疫情爆發(fā)階段有效防控了埃博拉病毒流入中國。在第二部分中,為解決之前基于MS2 VLP的miRNA遞送體系中,化學交聯方法存在的成功率低、成本高、周期長、步驟繁瑣等問題,我們采用噬菌體表面展示技術,制備了表面展示細胞穿透肽TAT內含pre-miR122的重組MS2 VLPs用于肝癌治療研究。我們首先明確上述展示TAT的VLPs是否具備細胞膜穿透功能及遞送miR122的能力。為進一步檢測內含pre-miR122表面展示TAT的MS2 VLPs對肝細胞癌的抑制效果,我們同時制備了內含pre-miR122表面化學交聯TAT的MS2 VLPs做為對比。通過CCK8、transwell小室、流式細胞術、Western blot及CT影像學分析、HE染色、免疫組化等方法,在細胞及動物水平明確上述兩種VLPs對肝癌的抑制效果及是否存在差異。結果證明,內含pre-miR122表面展示TAT的MS2 VLPs可成功穿透細胞膜,實現miR122的高效胞內遞送。應用表面展示TAT及化學交聯TAT的VLPs處理Hep3B、HepG2及Huh7三種肝癌細胞后可發(fā)現,上述兩種內含pre-miR122的VLPs對三種細胞均存在抑制作用,且表面展示TAT的VLPs抑制效果更加明顯。繼而我們選擇Hep3B細胞(VLPs處理后細胞水平腫瘤抑制效果最明顯)建立肝癌動物模型。對荷瘤組小鼠尾靜脈注射上述兩種VLPs后發(fā)現,表面展示TAT及化學交聯TAT內含pre-miR122的VLPs均可有效抑制腫瘤生長,且以前者抑制效果更明顯。以上結果提示,我們制備的基于表面展示TAT的重組MS2 VLP miR122遞送載體具有細胞穿透功能,體內、體外均對肝細胞癌具有抑制作用。與化學交聯TAT內含pre-miR122的VLPs相比,展示TAT的VLPs制備過程簡單、周期短、腫瘤抑制效果更加顯著,展現出良好的應用前景。
[Abstract]:The outbreak of Ebola haemorrhagic fever in West Africa in 2014 has attracted wide attention all over the world. China is close to West Africa. During the outbreak of the outbreak, the risk of Ebola disease from abroad is high and persisted. Improving the early accurate detection ability of the virus has become the key to our national defense control Ebola epidemic. Scope, especially important port cities, laboratories with aptitude test for Ebola virus detection, inspection and quarantine agencies, and so on. In December 2014, the Department of clinical inspection of the Ministry of health organized the relevant quality evaluation work. In view of the four level of the Ebola virus is a biological safety control virus, once the infection has a high death rate. Sex, the routine use of inactivated virus or the positive serum of infected patients to prepare quality control products is not suitable for this quality evaluation. Therefore, we choose the phage MS2 virus like Bacteriophage MS2 virus-like particles (MS2 VLPs), which has high biological safety and good protective effect, to prepare the 2014 West African epidemic strain. The Zaire type Ebola virus nucleocapsid protein (Nucleoprotein, NP) RNA full length, Glycoprotein (GP) and RNA dependent RNA polymerase L (Polymerase) RNA sequence of RNA polymerase L (Polymerase) RNA sequence are restructured MS2 VLPs quality control products. Double target test results), 14 institutions (73.68%) were fully correct, 3 institutions (15.79%) had a false negative result, 1 (5.26%) had two false negative results, and the remaining 1 institutions (5.26%) had more than 3 return error results. The results of all negative samples in this review sample were correct, and the above error returns were mainly concentrated on the results. For the detection of weak positive samples, in view of the false negative problems in this quality evaluation, we put forward some suggestions on the use of commercialized kits or standard primers provided by national CDC, probe detection, the use of double target detection methods, the standardized training of operators, and timely calibration of the instrument. In the second part, in the second part of the miRNA delivery system based on VLP, the success rate of the chemical crosslinking method is low, the cost is high, the cycle is long, and the steps are tedious. We use the phage surface. The recombinant MS2 VLPs containing pre-miR122 in surface display cell penetrating peptide TAT was prepared for the treatment of liver cancer. We first clearly demonstrated that the VLPs of TAT has the ability of cell membrane penetration and delivery of miR122. To further detect the inhibitory effect of MS2 VLPs on pre-miR122 containing TAT, the inhibitory effect of MS2 VLPs on hepatocellular carcinoma. We also made a comparison of MS2 VLPs containing pre-miR122 surface chemically linked TAT. Through CCK8, Transwell chamber, flow cytometry, Western blot and CT imaging analysis, HE staining, immunohistochemistry and other methods, the inhibitory effects and differences of these two VLPs on liver cancer were identified at cell and animal levels. The MS2 VLPs containing TAT on the surface of pre-miR122 can successfully penetrate the cell membrane and achieve the efficient intracellular delivery of miR122. After the application of the VLPs to treat Hep3B, HepG2 and Huh7 three hepatoma cells with the VLPs on the surface of TAT and chemical crosslinked TAT, the above two kinds of pre-miR122 are inhibited on the three cells and are displayed on the surface. The effect was more obvious. Then we selected Hep3B cells (the most obvious inhibitory effect of cell level after VLPs treatment) to establish the animal model of liver cancer. After injection of the two kinds of VLPs in the tail vein of the tumor bearing mice, it was found that the surface display of TAT and the VLPs containing pre-miR122 in the chemically crosslinked TAT could effectively inhibit the growth of the tumor, and the previous inhibition effect was effective. The results suggested that the above results suggest that the recombinant MS2 VLP miR122 delivery carrier based on the surface display TAT has cell penetration, both in vivo and in vitro have inhibitory effect on hepatocellular carcinoma. Compared with the VLPs containing pre-miR122 in chemical crosslinked TAT, the VLPs preparation process of TAT is simple, the cycle is short, and the tumor inhibition effect is more obvious. It shows a good prospect of application.
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.8

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本文編號：2006660