本文選題：艾滋病 + 人類免疫缺陷病毒��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：艾滋病,即獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)感染引起一種嚴重的傳染性疾病,以全身免疫系統(tǒng)嚴重損害為特征。聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署報告顯示,截至2012年底,全球有超過3530萬名艾滋病帶菌者,其中有260萬人是在2009年才確診染病,全球范圍內每天新增6300名艾滋病感染者。截至2014年2月,我國共報告現(xiàn)存活艾滋病病毒感染者和艾滋病病人約44.8萬例。艾滋病已在全球范圍內迅速蔓延,現(xiàn)已成為當今世界最危險的流行病之一,嚴重威脅著人類的生命和健康。如果防治措施不力,將對我國的人口健康和經(jīng)濟社會發(fā)展產生巨大的影響。 當前,抗病毒藥物治療依然是防治艾滋病的主要方法。目前上市的抗HIV藥物主要包括：蛋白酶抑制劑(Protease inhibitors, PIs)、逆轉錄酶抑制劑,包括核苷類逆轉錄酶抑制劑(Nucleotide reverse transcriptase inhibitors, NRTIs)和非核苷類逆轉錄酶抑制劑(Non-nucleotide reverse transcriptase inhibitors, NNRTIs)、整合酶抑制劑(Integrase Inhibitors)、以及進入抑制劑(HIV entry inhibitors)。臨床上主要采用聯(lián)合用藥的方式進行治療,即俗稱“雞尾酒療法”的高效抗逆轉錄病毒療法——Highly active anti-retroviral therapy, HAART)。雞尾酒療法通常由兩種逆轉錄酶抑制劑和一種蛋白酶抑制劑組成,其利用不同靶標、不同作用環(huán)節(jié)的抗HIV藥物的協(xié)同作用,有效地抑制HIV在人體內的復制,大大降低了病毒的發(fā)病率和死亡率,延長了患者壽命。但現(xiàn)有的大多數(shù)蛋白酶抑制劑和逆轉錄酶抑制劑被發(fā)現(xiàn)無法完全清除體內的HIV病毒,并且長期用藥還易導致藥物的耐藥性,毒副作用,病人的耐受性,還存在費用高昂等突出問題。面對艾滋病全球蔓延的形勢以及現(xiàn)有藥物的局限性,臨床上迫切需要高效低毒,使用方便,價格便宜的新型抗HIV藥物[1]。 HIV病毒只有在進入宿主細胞內后才能進行復制,進而導致細胞病變,而逆轉錄酶及蛋白酶抑制劑都是在病毒進入細胞后才發(fā)揮作用。HIV進入抑制劑能夠阻止病毒進入細胞,在病毒復制早期即發(fā)揮抗病毒作用,因而對耐受前兩類抗HIV藥物的病毒依然有效,并可組成更多的“雞尾酒”方案,用于艾滋病的治療。因此,開發(fā)新的阻止HIV病毒進入靶細胞的HIV進入抑制劑已經(jīng)成為目前抗艾滋病藥物研發(fā)的熱點。 HIV進入靶細胞的過程是由其包膜蛋白gp160所介導的,gp160由兩個亞基gp120和gp41通過非共價鍵連接。在HIV進入過程中,首先是gp120與靶細胞上的CD4分子和輔助受體(趨化因子受體CCR5或CXCR4等)先后結合,隨后跨膜亞基gp41的構型發(fā)生改變,介導病毒包膜與靶細胞膜的融合,完成病毒進入宿主細胞的感染過程。由于gp41的序列在病毒包膜蛋白中較為保守,且是病毒特有的蛋白,以其作為研究HIV進入抑制劑的藥物靶點具有較大的優(yōu)勢。目前,主要以gp41形成的核心六螺旋束結構作為藥物靶點之一。HIV gp41膜外部分具有兩個螺旋重復序列,分別稱為NHR和CHR。三分子gp41上的NHR與CHR分別發(fā)生反向結合,形成穩(wěn)定的六螺旋束(6-Helix Bundle,6-HB)結構,將病毒包膜與靶細胞膜的距離拉近而發(fā)生融合,介導HIV進入靶細胞內。HIV進入抑制劑T-20即是衍生于gp41CHR的一段具有抑制HIV與靶細胞融合和抗HIV感染作用的多肽。如果小分子化合物能抑制HIV gp41六螺旋束的形成,也將具有抑制HIV進入靶細胞的作用。2004年,紐約血液中心姜世勃教授篩選到2個“藥物樣(drug-like)"化合物,NB-2和NB-64[2]。但是,NB-2和NB-64的有效濃度僅在μM級別,遠遠大于T-20的用量,但可將其作為HIV進入抑制劑的先導化合物(hit),有望研發(fā)出更具效能的新型藥物。 正是基于這一思路,本課題組與軍事醫(yī)學科學院藥理毒理研究所謝藍教授團隊合作,采用假病毒體系、體外模擬六螺旋形成的ELISA等方法篩選來自NB-64結構改造后的一系列的小分子化合物,從中發(fā)現(xiàn)了兩個具有高效抗HIV-1活性且靶向于gp41的化合物。進一步采用多種分子生物學、生物物理學等實驗方法探討了這兩個化合物的抗病毒的活性、作用機制及作用靶點。為后續(xù)產物的結構優(yōu)化,尋找更多更有效的HIV-1進入抑制劑奠定基礎。 目前,HIV-1gp41靶點的藥物設計大多是基于NHR和CHR形成六螺旋束結構,而針對疏水性功能區(qū)域融合多肽(fusion peptide, FP)和跨膜區(qū)域(transmembrane domain, TMD)也逐漸成為人們研究和開發(fā)的重點。但目前尚未發(fā)現(xiàn)針于上述位點的有效藥物。那么,在gp41上,是否還有其他位點也能夠成為抑制HIV進入的靶點呢?這使得我們首先要對gp41各部位的功能和作用有更詳細和深入的了解。HIV-1gp41NHR和CHR之間的連結區(qū)域loop,是在gp41上被發(fā)現(xiàn)的第三個疏水性區(qū)域,其序列也較為保守,已被證明在gp41介導融合的過程中至關重要。Loop的中心疏水區(qū)域存在一對保守的二硫鍵,兩個半胱氨酸之間601位的堿性賴氨酸為這一段序列中唯一的親水性氨基酸,可推測其在loop形態(tài)和功能中的重要性。因此,我們合成了包含中心區(qū)域的27個氨基酸的loop區(qū)域多肽以及K601A,L602A突變的loop多肽,研究其突變后對loop結構和作用的影響。這些結果將幫助我們更好的理解gp41在病毒膜與細胞膜融合過程中的作用和機制,為尋找更多可能的藥物作用靶點指明方向。 本課題為開發(fā)新的HIV病毒進入抑制劑提供新的思路。 第一部分靶向gp41的HIV-1進入抑制劑的研究 目的： 通過高通量篩選方法篩選出具有抑制HIV-1感染靶細胞作用的小分子化合物,研究該化合物抗HIV-1進入的活性,評價其體外細胞毒性,并深入探討其作用機制及可能的作用靶點。 方法： 1.用pSFl62病毒包膜蛋白質粒與pNL4-3.Luc.RF核心質粒共轉染構建HIV-1假病毒,篩選化合物抑制假病毒感染的活性；抑制gp41六螺旋束結構形成的酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)快速檢測化合物是否能夠阻止NHR和CHR的結合。共有11個待檢測系列化合物,陽性對照藥物為T20或NB-64,PBS為陰性對照。 2.通過假病毒體系包裝HIV-1SF162、HIV-1JR-FL、HIV-1HXB2和VSV-G假病毒,檢測有抗病毒活性的化合物是否具有抗HIV-1進入靶細胞的作用。同時利用細胞-細胞融合方法初步確定化合物在病毒復制周期中的作用機制和藥物靶點。實驗時檢測化合物在50μM、25μM、12.5μM、6.25μM和3.125μM五個梯度稀釋濃度時的作用,陽性對照藥物為T20,PBS為陰性對照。 3.MTT法評價化合物在100μM和6.25μM五個梯度稀釋濃度時在體外對HIV-1作用靶細胞的細胞毒性,陽性對照藥物為T20,陰性對照為PBS。 4.用酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(N-PAGE)、圓二色譜法(Circular Dichroism, CD)檢測化合物抑制HIV gp41六螺旋束結構形成的活性。建立在細胞水平上的ELISA法檢測化合物抑制抗CXCR4單抗與表達CXCR4細胞結合的活性。其中,ELISA選用50μM、25μM、12.5μM6.25μM和3.125μM五個梯度稀釋濃度,N-PAGE選用400μM、200μM、100μM、50pM和25μM五個梯度稀釋濃度,CD法為20μM,cell-based ELISA為25μM。陽性對照藥物為NB-64、ADS-J1或AMD3100,PBS為陰性對照 5.利用點突變技術對可能的作用靶點W571、K574、Q577和R579在pJR-FL質粒上進行改造,包裝基因突變的假病毒,探討化合物在HIV gp41上的作用靶點。實驗時檢測化合物在50μM、25μM、12.5μM、6025μM和3.125μM五個梯度稀釋濃度時的作用,陽性對照藥物為T20,PBS為陰性對照。 6.采用Sigma Plot作圖。采用GraphPad Prism5.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)結果以x±s表示,多組間均數(shù)比較采用One way-ANOVA,多個組分別與對照組比較采用Dunnett檢驗；兩組數(shù)據(jù)間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗,p0.05具有統(tǒng)計學顯著性差異；劑量依賴反應關系分析取X=Log(X)后,采用Nonlinear regression和Pearson分析,Linear regression計算回歸方程。 結果： 1.從來源于先導化合物NB-64的系列小分子化合物中篩選出XLHX-124-50和XLHX-130-7,兩者在25μM時能夠抑制HIV-1SF162假病毒感染(F=37.90,P=0.0000),且能抑制N36和C34結合形成六螺旋束結構(F=302.8,P=0.0000)。 2. XLHX-124-50和XLHX-130-7對HIV-1SF16、HIV-1JR-FL和HIV-1HXB2這三種假病毒株的抑制作用呈劑量依賴性(r=0.9855、P=0.0021,r=0.9933、P=0.0007, r=0.9483、P=0.0140和r=0.9253、P=0.0242,r=0.9483、P=0.0140,r=0.8930、 P=0.0413)。XLHX-124-50抑制HIV-1SF16、HIV-1JR-FL和HIV-1HXB2感染的IC50分別為19.65±2.63μM,13.95±3.34μM,23.09±1.10μM;XLHX-130-7抑制HIV-1SF16、HIV-1JR-FL和HIV-1HXB2感染的IC50分別為13.13±4.55μM,13.82±3.06μM,24.96±0.60μM。兩個化合物均對VSV-G假病毒無明顯的抑制作用(P0.05),但由于樣本量較小,尚不能完全否認其作用。細胞-細胞融合結果顯示XLHX-124-50和XLHX-130-7均能有效抑制MT-2和CHO-WT細胞的融合,其IC50分別為14.44±1.24μM和9.54±0.37gM,兩個化合物對細胞融合的抑制作用與劑量呈顯著正相關關系(r=0.9800、P=0.0034, r=0.9718、P=0.0057)。 3.XLHX-124-50和XLHX-130-7對各靶細胞U87.CD4.CCR5,U87.CD4.CXCR4, MT-2以及實驗用細胞CHO-WT的體外細胞毒性作用均較低,其CC50值大于其抑制HIV-1假病毒的IC50值。 4.利用衍生于HIV gp41NHR和CHR區(qū)域的多肽N36和C34,可以在體外形成類似gp41NHR和CHR結合的六螺旋束結構。因此,抗HIV gp41核心六螺旋束結構的活性可以用抑制N36和C34的結合來測定。ELISA法顯示,XLHX-124-50和XLHX-130-7均能夠抑制gp41六螺旋束結構形成,其作用呈劑量依賴性(r=0.9593、P=0.0098,r=0.9542、P=0.0117),IC50分別是23.05±1.44μM和10.29±0.76μM。天然聚丙烯酰胺凝膠電泳通過比較gp4l核心結構條帶形成的強弱來判斷化合物對N36和C34六螺旋束形成的影響,圓二色譜法直觀顯示了N36和C34形成的多肽二級結構,結果均證實XLHX-124-50和XLHX-130-7均能劑量依賴性地抑制gp41六螺旋束的形成。 5.細胞水平上的ELISA檢測顯示XLHX-124-50和XLHX-130-7沒有抑制抗CXCR4單抗與表達CXCR4細胞結合的活性,其作用后的OD450值與PBS組比沒有顯著性差異(P0.05),但樣本量較小,所以尚不能完全排除化合物在高濃度時抑制單抗與細胞結合的作用。 6. XLHX-124-50和XLHX-130-7均能劑量依賴性的作用于W571A、Q577A及R579A突變型HIV-1JR-FL假病毒(r=0.9267、P=0.0235,r=0.9204、P=0.0266, r=0.9399、P=0.0175和r=0.8997、P=0.0375,r=0.9035、P=0.0355,r=0.9648、 P=0.0079),且抑制水平與野生型假病毒接近。但兩個化合物都不能夠抑制K574D突變的假病毒對靶細胞的感染。 結論： 篩選自一系列來源于先導化合物NB-64的小分子化合物發(fā)現(xiàn),XLHX-124-50和XLHX-130-7具有抗HIV-1進入的活性,其作用靶點可能是HIV-1gp41NHR 口袋區(qū)574位的賴氨酸殘基。但是對于抗HIV-1的候選藥物來說,其有效濃度依然在μM水平,且毒性CC50與抑制作用的IC50相差不顯著,兩個化合物可做為HIV-1進入抑制劑的先導化合物進行后續(xù)研究。 第二部分HIV-1gp41Loop疏水中心的功能研究 目的： 合成突變了氨基酸位點的HIV-1gp41loop多肽(27aa),利用分子生物學、生物化學及生物物理學等多種實驗方法研究其二硫鍵疏水中心疏水性的變化對loop區(qū)域在包膜內外功能和結構所產生的影響。 方法： 1.采用Fmoc固相合成法,合成多肽：L27WT為野生型的含有l(wèi)oop中心區(qū)域的27個氨基酸的loop多肽,L27K601A為突變601位賴氨酸為丙氨酸的loop多肽,L27L602A為突變602位亮氨酸為丙氨酸的loop多肽。 2.通過所有的通用蛋白質資源庫(universal protein resource, UniProt)建立HIV和SIV包膜上的跨膜蛋白的數(shù)據(jù)資料,運用生物信息學方法,分析loop多肽的序列及疏水性,以及突變后多肽疏水性的改變。 3.用RP-HPLC法直接測定loop多肽L27中心區(qū)域半胱氨酸的氧化動力學。含巰基的化合物可以與DTNB發(fā)生反應,利用DTNB直接顯色法可以檢測多肽在溶液中所含游離巰基的濃度,通過比較氧化前后的數(shù)據(jù),計算出L27中半胱氨酸在溶液或脂質體溶液內是否形成二硫鍵及其程度。 4.用ELISA的方法,檢測了三種抗loop的單克隆抗體T32、240-D、246-D與各多肽之間的結合能力。比較突變后的多肽是否使loop的蛋白結構發(fā)生了改變,從而影響其固有的抗原表位,進而減少蛋白與抗體的結合。 5.通過圓二色譜法(Circular Dichroism, CD)檢測loop多肽L27WT,L27K601A和L27L602A在水溶液和L-a-溶血磷脂酰膽堿(LPC)溶液中二級蛋白結構的變化。 6. Loop序列中含有色氨酸(Trp,W)殘基,通過熒光偏振的方法檢測色氨酸在脂質體(PC:Chol為9：1)中的含量,分析和定量loop多肽L27WT,L27K601A和L27L602A與膜的結合,分析計算得到多肽與脂質體模擬的兩性離子膜的結合能力。 7.細胞膜和病毒的包膜皆為磷脂雙分子層,膜的融合包括了內外膜的融合。通過熒光探針稀釋實驗來檢測兩性離子的脂質體融合,研究突變的多肽對于膜與膜融合的影響。 8.采用Sigma Plot作圖。采用GraphPad Prism5.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)結果以x±s表示,多組間均數(shù)比較采用One way-ANOVA,多個組分別與對照組比較采用Dunnett檢驗；兩組數(shù)據(jù)間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗,p0.05具有統(tǒng)計學顯著性差異。 結果： 1.多肽的生物學分析顯示,loop中心區(qū)域的兩個半胱氨酸在序列中非常保守,而另一個堿性殘基(賴氨酸K或精氨酸R)也在loop中心內相對保守,K601和L602突變后,多肽的疏水性發(fā)生了改變。RP-HPLC的結果也驗證了該結果。 2. DTNB直接顯色法顯示,Loop WT可以在水溶液狀態(tài)下發(fā)生氧化,L602A不會減少loop多肽形成二硫鍵的能力,而K601A發(fā)生氧化反應的能力顯著下降(t=6.917,P=0.0023),尤其當loop多肽處于膜狀態(tài)下時(t=4.694,P=0.0094)。RP-HPLC與DTNB檢測法的結果相似,L27K601A明顯降低了疏水性增加的速度,即減少了loop多肽形成二硫鍵的能力。 3.L27WT對抗loop抗體T32、246-D和240-D的親和常數(shù)分別為4.4×10±106±1.5x106M-1,4.3×107±0.8×107M-1,1.9×107±0.4×107M-1。L27K601A和L27L602A均不能與T32結合,兩者與240-D的親和常數(shù)分別是8.6×106±1.4×106M-1和8.4×106±1.9×106M-1,L27L602A與236-D的親和常數(shù)為6.1×107±0.2×107,而L27K601A卻不能與246-D結合。 4.在HEPES水溶液中,L27WT和L27L602A均呈現(xiàn)一種無規(guī)則的彎曲結構,而L27K601A有少量的α-螺旋結構。在膜模擬的環(huán)境中(1%LPC),L27WT有非常明顯的α-螺旋,L27K601A和L27L602A與其有少量的α-螺旋含量差異。 5.通過熒光偏振的方法檢測色氨酸在脂質體中的含量,檢測到L27WT,L27K601A和L27L602A與膜的結合常數(shù)分別為3.8×103±0.5×103M-1,7.2×103±1.8×103M-1,1.5×103±0.9×103M-1。 6.熒光探針稀釋實驗檢測兩性離子膜與膜融合的結果顯示,與L27WT相比,L27K601A可以增加膜的融合(t=5.439,P=0.0055),L27L602A卻明顯減弱了融合能力(t=15.42,P=0.0001)=L27K601A促進的幾乎都是膜的全融合,其內膜的融合比L27WT增加了40%,而L27L602A則大部分為外膜的融合。 結論： HIV-1gp41loop疏水中心區(qū)域二硫鍵之間的601位為親水性的堿性殘基賴氨酸,其并非是膜外部分決定loop結構和功能的唯一因素,但是能夠平衡loop區(qū)域的的疏水性和極性,從而幫助gp41loop在融合進入過程的每一步驟中保持正確的結構,同時在膜的外側發(fā)生氧化反應,并且引導膜上脂質體的結合。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R512.91

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1 裘佳寅;靶向HIV-1 gp41的病毒進入抑制劑的篩選及gp41 Loop疏水中心的功能研究[D];南方醫(yī)科大學;2014年

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本文編號：1999465