本文選題：艾滋病 + 人類免疫缺陷病毒��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：艾滋病,即獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)感染引起一種嚴(yán)重的傳染性疾病,以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征。聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署報告顯示,截至2012年底,全球有超過3530萬名艾滋病帶菌者,其中有260萬人是在2009年才確診染病,全球范圍內(nèi)每天新增6300名艾滋病感染者。截至2014年2月,我國共報告現(xiàn)存活艾滋病病毒感染者和艾滋病病人約44.8萬例。艾滋病已在全球范圍內(nèi)迅速蔓延,現(xiàn)已成為當(dāng)今世界最危險的流行病之一,嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康。如果防治措施不力,將對我國的人口健康和經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響。 當(dāng)前,抗病毒藥物治療依然是防治艾滋病的主要方法。目前上市的抗HIV藥物主要包括：蛋白酶抑制劑(Protease inhibitors, PIs)、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑,包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(Nucleotide reverse transcriptase inhibitors, NRTIs)和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(Non-nucleotide reverse transcriptase inhibitors, NNRTIs)、整合酶抑制劑(Integrase Inhibitors)、以及進(jìn)入抑制劑(HIV entry inhibitors)。臨床上主要采用聯(lián)合用藥的方式進(jìn)行治療,即俗稱“雞尾酒療法”的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法——Highly active anti-retroviral therapy, HAART)。雞尾酒療法通常由兩種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和一種蛋白酶抑制劑組成,其利用不同靶標(biāo)、不同作用環(huán)節(jié)的抗HIV藥物的協(xié)同作用,有效地抑制HIV在人體內(nèi)的復(fù)制,大大降低了病毒的發(fā)病率和死亡率,延長了患者壽命。但現(xiàn)有的大多數(shù)蛋白酶抑制劑和逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑被發(fā)現(xiàn)無法完全清除體內(nèi)的HIV病毒,并且長期用藥還易導(dǎo)致藥物的耐藥性,毒副作用,病人的耐受性,還存在費(fèi)用高昂等突出問題。面對艾滋病全球蔓延的形勢以及現(xiàn)有藥物的局限性,臨床上迫切需要高效低毒,使用方便,價格便宜的新型抗HIV藥物[1]。 HIV病毒只有在進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)后才能進(jìn)行復(fù)制,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞病變,而逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶抑制劑都是在病毒進(jìn)入細(xì)胞后才發(fā)揮作用。HIV進(jìn)入抑制劑能夠阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞,在病毒復(fù)制早期即發(fā)揮抗病毒作用,因而對耐受前兩類抗HIV藥物的病毒依然有效,并可組成更多的“雞尾酒”方案,用于艾滋病的治療。因此,開發(fā)新的阻止HIV病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的HIV進(jìn)入抑制劑已經(jīng)成為目前抗艾滋病藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。 HIV進(jìn)入靶細(xì)胞的過程是由其包膜蛋白gp160所介導(dǎo)的,gp160由兩個亞基gp120和gp41通過非共價鍵連接。在HIV進(jìn)入過程中,首先是gp120與靶細(xì)胞上的CD4分子和輔助受體(趨化因子受體CCR5或CXCR4等)先后結(jié)合,隨后跨膜亞基gp41的構(gòu)型發(fā)生改變,介導(dǎo)病毒包膜與靶細(xì)胞膜的融合,完成病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的感染過程。由于gp41的序列在病毒包膜蛋白中較為保守,且是病毒特有的蛋白,以其作為研究HIV進(jìn)入抑制劑的藥物靶點(diǎn)具有較大的優(yōu)勢。目前,主要以gp41形成的核心六螺旋束結(jié)構(gòu)作為藥物靶點(diǎn)之一。HIV gp41膜外部分具有兩個螺旋重復(fù)序列,分別稱為NHR和CHR。三分子gp41上的NHR與CHR分別發(fā)生反向結(jié)合,形成穩(wěn)定的六螺旋束(6-Helix Bundle,6-HB)結(jié)構(gòu),將病毒包膜與靶細(xì)胞膜的距離拉近而發(fā)生融合,介導(dǎo)HIV進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)。HIV進(jìn)入抑制劑T-20即是衍生于gp41CHR的一段具有抑制HIV與靶細(xì)胞融合和抗HIV感染作用的多肽。如果小分子化合物能抑制HIV gp41六螺旋束的形成,也將具有抑制HIV進(jìn)入靶細(xì)胞的作用。2004年,紐約血液中心姜世勃教授篩選到2個“藥物樣(drug-like)"化合物,NB-2和NB-64[2]。但是,NB-2和NB-64的有效濃度僅在μM級別,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于T-20的用量,但可將其作為HIV進(jìn)入抑制劑的先導(dǎo)化合物(hit),有望研發(fā)出更具效能的新型藥物。 正是基于這一思路,本課題組與軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥理毒理研究所謝藍(lán)教授團(tuán)隊合作,采用假病毒體系、體外模擬六螺旋形成的ELISA等方法篩選來自NB-64結(jié)構(gòu)改造后的一系列的小分子化合物,從中發(fā)現(xiàn)了兩個具有高效抗HIV-1活性且靶向于gp41的化合物。進(jìn)一步采用多種分子生物學(xué)、生物物理學(xué)等實驗方法探討了這兩個化合物的抗病毒的活性、作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)。為后續(xù)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化,尋找更多更有效的HIV-1進(jìn)入抑制劑奠定基礎(chǔ)。 目前,HIV-1gp41靶點(diǎn)的藥物設(shè)計大多是基于NHR和CHR形成六螺旋束結(jié)構(gòu),而針對疏水性功能區(qū)域融合多肽(fusion peptide, FP)和跨膜區(qū)域(transmembrane domain, TMD)也逐漸成為人們研究和開發(fā)的重點(diǎn)。但目前尚未發(fā)現(xiàn)針于上述位點(diǎn)的有效藥物。那么,在gp41上,是否還有其他位點(diǎn)也能夠成為抑制HIV進(jìn)入的靶點(diǎn)呢?這使得我們首先要對gp41各部位的功能和作用有更詳細(xì)和深入的了解。HIV-1gp41NHR和CHR之間的連結(jié)區(qū)域loop,是在gp41上被發(fā)現(xiàn)的第三個疏水性區(qū)域,其序列也較為保守,已被證明在gp41介導(dǎo)融合的過程中至關(guān)重要。Loop的中心疏水區(qū)域存在一對保守的二硫鍵,兩個半胱氨酸之間601位的堿性賴氨酸為這一段序列中唯一的親水性氨基酸,可推測其在loop形態(tài)和功能中的重要性。因此,我們合成了包含中心區(qū)域的27個氨基酸的loop區(qū)域多肽以及K601A,L602A突變的loop多肽,研究其突變后對loop結(jié)構(gòu)和作用的影響。這些結(jié)果將幫助我們更好的理解gp41在病毒膜與細(xì)胞膜融合過程中的作用和機(jī)制,為尋找更多可能的藥物作用靶點(diǎn)指明方向。 本課題為開發(fā)新的HIV病毒進(jìn)入抑制劑提供新的思路。 第一部分靶向gp41的HIV-1進(jìn)入抑制劑的研究 目的： 通過高通量篩選方法篩選出具有抑制HIV-1感染靶細(xì)胞作用的小分子化合物,研究該化合物抗HIV-1進(jìn)入的活性,評價其體外細(xì)胞毒性,并深入探討其作用機(jī)制及可能的作用靶點(diǎn)。 方法： 1.用pSFl62病毒包膜蛋白質(zhì)粒與pNL4-3.Luc.RF核心質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染構(gòu)建HIV-1假病毒,篩選化合物抑制假病毒感染的活性；抑制gp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)快速檢測化合物是否能夠阻止NHR和CHR的結(jié)合。共有11個待檢測系列化合物,陽性對照藥物為T20或NB-64,PBS為陰性對照。 2.通過假病毒體系包裝HIV-1SF162、HIV-1JR-FL、HIV-1HXB2和VSV-G假病毒,檢測有抗病毒活性的化合物是否具有抗HIV-1進(jìn)入靶細(xì)胞的作用。同時利用細(xì)胞-細(xì)胞融合方法初步確定化合物在病毒復(fù)制周期中的作用機(jī)制和藥物靶點(diǎn)。實驗時檢測化合物在50μM、25μM、12.5μM、6.25μM和3.125μM五個梯度稀釋濃度時的作用,陽性對照藥物為T20,PBS為陰性對照。 3.MTT法評價化合物在100μM和6.25μM五個梯度稀釋濃度時在體外對HIV-1作用靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性,陽性對照藥物為T20,陰性對照為PBS。 4.用酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(N-PAGE)、圓二色譜法(Circular Dichroism, CD)檢測化合物抑制HIV gp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的活性。建立在細(xì)胞水平上的ELISA法檢測化合物抑制抗CXCR4單抗與表達(dá)CXCR4細(xì)胞結(jié)合的活性。其中,ELISA選用50μM、25μM、12.5μM6.25μM和3.125μM五個梯度稀釋濃度,N-PAGE選用400μM、200μM、100μM、50pM和25μM五個梯度稀釋濃度,CD法為20μM,cell-based ELISA為25μM。陽性對照藥物為NB-64、ADS-J1或AMD3100,PBS為陰性對照 5.利用點(diǎn)突變技術(shù)對可能的作用靶點(diǎn)W571、K574、Q577和R579在pJR-FL質(zhì)粒上進(jìn)行改造,包裝基因突變的假病毒,探討化合物在HIV gp41上的作用靶點(diǎn)。實驗時檢測化合物在50μM、25μM、12.5μM、6025μM和3.125μM五個梯度稀釋濃度時的作用,陽性對照藥物為T20,PBS為陰性對照。 6.采用Sigma Plot作圖。采用GraphPad Prism5.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示,多組間均數(shù)比較采用One way-ANOVA,多個組分別與對照組比較采用Dunnett檢驗；兩組數(shù)據(jù)間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗,p0.05具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異；劑量依賴反應(yīng)關(guān)系分析取X=Log(X)后,采用Nonlinear regression和Pearson分析,Linear regression計算回歸方程。 結(jié)果： 1.從來源于先導(dǎo)化合物NB-64的系列小分子化合物中篩選出XLHX-124-50和XLHX-130-7,兩者在25μM時能夠抑制HIV-1SF162假病毒感染(F=37.90,P=0.0000),且能抑制N36和C34結(jié)合形成六螺旋束結(jié)構(gòu)(F=302.8,P=0.0000)。 2. XLHX-124-50和XLHX-130-7對HIV-1SF16、HIV-1JR-FL和HIV-1HXB2這三種假病毒株的抑制作用呈劑量依賴性(r=0.9855、P=0.0021,r=0.9933、P=0.0007, r=0.9483、P=0.0140和r=0.9253、P=0.0242,r=0.9483、P=0.0140,r=0.8930、 P=0.0413)。XLHX-124-50抑制HIV-1SF16、HIV-1JR-FL和HIV-1HXB2感染的IC50分別為19.65±2.63μM,13.95±3.34μM,23.09±1.10μM;XLHX-130-7抑制HIV-1SF16、HIV-1JR-FL和HIV-1HXB2感染的IC50分別為13.13±4.55μM,13.82±3.06μM,24.96±0.60μM。兩個化合物均對VSV-G假病毒無明顯的抑制作用(P0.05),但由于樣本量較小,尚不能完全否認(rèn)其作用。細(xì)胞-細(xì)胞融合結(jié)果顯示XLHX-124-50和XLHX-130-7均能有效抑制MT-2和CHO-WT細(xì)胞的融合,其IC50分別為14.44±1.24μM和9.54±0.37gM,兩個化合物對細(xì)胞融合的抑制作用與劑量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.9800、P=0.0034, r=0.9718、P=0.0057)。 3.XLHX-124-50和XLHX-130-7對各靶細(xì)胞U87.CD4.CCR5,U87.CD4.CXCR4, MT-2以及實驗用細(xì)胞CHO-WT的體外細(xì)胞毒性作用均較低,其CC50值大于其抑制HIV-1假病毒的IC50值。 4.利用衍生于HIV gp41NHR和CHR區(qū)域的多肽N36和C34,可以在體外形成類似gp41NHR和CHR結(jié)合的六螺旋束結(jié)構(gòu)。因此,抗HIV gp41核心六螺旋束結(jié)構(gòu)的活性可以用抑制N36和C34的結(jié)合來測定。ELISA法顯示,XLHX-124-50和XLHX-130-7均能夠抑制gp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成,其作用呈劑量依賴性(r=0.9593、P=0.0098,r=0.9542、P=0.0117),IC50分別是23.05±1.44μM和10.29±0.76μM。天然聚丙烯酰胺凝膠電泳通過比較gp4l核心結(jié)構(gòu)條帶形成的強(qiáng)弱來判斷化合物對N36和C34六螺旋束形成的影響,圓二色譜法直觀顯示了N36和C34形成的多肽二級結(jié)構(gòu),結(jié)果均證實XLHX-124-50和XLHX-130-7均能劑量依賴性地抑制gp41六螺旋束的形成。 5.細(xì)胞水平上的ELISA檢測顯示XLHX-124-50和XLHX-130-7沒有抑制抗CXCR4單抗與表達(dá)CXCR4細(xì)胞結(jié)合的活性,其作用后的OD450值與PBS組比沒有顯著性差異(P0.05),但樣本量較小,所以尚不能完全排除化合物在高濃度時抑制單抗與細(xì)胞結(jié)合的作用。 6. XLHX-124-50和XLHX-130-7均能劑量依賴性的作用于W571A、Q577A及R579A突變型HIV-1JR-FL假病毒(r=0.9267、P=0.0235,r=0.9204、P=0.0266, r=0.9399、P=0.0175和r=0.8997、P=0.0375,r=0.9035、P=0.0355,r=0.9648、 P=0.0079),且抑制水平與野生型假病毒接近。但兩個化合物都不能夠抑制K574D突變的假病毒對靶細(xì)胞的感染。 結(jié)論： 篩選自一系列來源于先導(dǎo)化合物NB-64的小分子化合物發(fā)現(xiàn),XLHX-124-50和XLHX-130-7具有抗HIV-1進(jìn)入的活性,其作用靶點(diǎn)可能是HIV-1gp41NHR 口袋區(qū)574位的賴氨酸殘基。但是對于抗HIV-1的候選藥物來說,其有效濃度依然在μM水平,且毒性CC50與抑制作用的IC50相差不顯著,兩個化合物可做為HIV-1進(jìn)入抑制劑的先導(dǎo)化合物進(jìn)行后續(xù)研究。 第二部分HIV-1gp41Loop疏水中心的功能研究 目的： 合成突變了氨基酸位點(diǎn)的HIV-1gp41loop多肽(27aa),利用分子生物學(xué)、生物化學(xué)及生物物理學(xué)等多種實驗方法研究其二硫鍵疏水中心疏水性的變化對loop區(qū)域在包膜內(nèi)外功能和結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的影響。 方法： 1.采用Fmoc固相合成法,合成多肽：L27WT為野生型的含有l(wèi)oop中心區(qū)域的27個氨基酸的loop多肽,L27K601A為突變601位賴氨酸為丙氨酸的loop多肽,L27L602A為突變602位亮氨酸為丙氨酸的loop多肽。 2.通過所有的通用蛋白質(zhì)資源庫(universal protein resource, UniProt)建立HIV和SIV包膜上的跨膜蛋白的數(shù)據(jù)資料,運(yùn)用生物信息學(xué)方法,分析loop多肽的序列及疏水性,以及突變后多肽疏水性的改變。 3.用RP-HPLC法直接測定loop多肽L27中心區(qū)域半胱氨酸的氧化動力學(xué)。含巰基的化合物可以與DTNB發(fā)生反應(yīng),利用DTNB直接顯色法可以檢測多肽在溶液中所含游離巰基的濃度,通過比較氧化前后的數(shù)據(jù),計算出L27中半胱氨酸在溶液或脂質(zhì)體溶液內(nèi)是否形成二硫鍵及其程度。 4.用ELISA的方法,檢測了三種抗loop的單克隆抗體T32、240-D、246-D與各多肽之間的結(jié)合能力。比較突變后的多肽是否使loop的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,從而影響其固有的抗原表位,進(jìn)而減少蛋白與抗體的結(jié)合。 5.通過圓二色譜法(Circular Dichroism, CD)檢測loop多肽L27WT,L27K601A和L27L602A在水溶液和L-a-溶血磷脂酰膽堿(LPC)溶液中二級蛋白結(jié)構(gòu)的變化。 6. Loop序列中含有色氨酸(Trp,W)殘基,通過熒光偏振的方法檢測色氨酸在脂質(zhì)體(PC:Chol為9：1)中的含量,分析和定量loop多肽L27WT,L27K601A和L27L602A與膜的結(jié)合,分析計算得到多肽與脂質(zhì)體模擬的兩性離子膜的結(jié)合能力。 7.細(xì)胞膜和病毒的包膜皆為磷脂雙分子層,膜的融合包括了內(nèi)外膜的融合。通過熒光探針稀釋實驗來檢測兩性離子的脂質(zhì)體融合,研究突變的多肽對于膜與膜融合的影響。 8.采用Sigma Plot作圖。采用GraphPad Prism5.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示,多組間均數(shù)比較采用One way-ANOVA,多個組分別與對照組比較采用Dunnett檢驗；兩組數(shù)據(jù)間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗,p0.05具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。 結(jié)果： 1.多肽的生物學(xué)分析顯示,loop中心區(qū)域的兩個半胱氨酸在序列中非常保守,而另一個堿性殘基(賴氨酸K或精氨酸R)也在loop中心內(nèi)相對保守,K601和L602突變后,多肽的疏水性發(fā)生了改變。RP-HPLC的結(jié)果也驗證了該結(jié)果。 2. DTNB直接顯色法顯示,Loop WT可以在水溶液狀態(tài)下發(fā)生氧化,L602A不會減少loop多肽形成二硫鍵的能力,而K601A發(fā)生氧化反應(yīng)的能力顯著下降(t=6.917,P=0.0023),尤其當(dāng)loop多肽處于膜狀態(tài)下時(t=4.694,P=0.0094)。RP-HPLC與DTNB檢測法的結(jié)果相似,L27K601A明顯降低了疏水性增加的速度,即減少了loop多肽形成二硫鍵的能力。 3.L27WT對抗loop抗體T32、246-D和240-D的親和常數(shù)分別為4.4×10±106±1.5x106M-1,4.3×107±0.8×107M-1,1.9×107±0.4×107M-1。L27K601A和L27L602A均不能與T32結(jié)合,兩者與240-D的親和常數(shù)分別是8.6×106±1.4×106M-1和8.4×106±1.9×106M-1,L27L602A與236-D的親和常數(shù)為6.1×107±0.2×107,而L27K601A卻不能與246-D結(jié)合。 4.在HEPES水溶液中,L27WT和L27L602A均呈現(xiàn)一種無規(guī)則的彎曲結(jié)構(gòu),而L27K601A有少量的α-螺旋結(jié)構(gòu)。在膜模擬的環(huán)境中(1%LPC),L27WT有非常明顯的α-螺旋,L27K601A和L27L602A與其有少量的α-螺旋含量差異。 5.通過熒光偏振的方法檢測色氨酸在脂質(zhì)體中的含量,檢測到L27WT,L27K601A和L27L602A與膜的結(jié)合常數(shù)分別為3.8×103±0.5×103M-1,7.2×103±1.8×103M-1,1.5×103±0.9×103M-1。 6.熒光探針稀釋實驗檢測兩性離子膜與膜融合的結(jié)果顯示,與L27WT相比,L27K601A可以增加膜的融合(t=5.439,P=0.0055),L27L602A卻明顯減弱了融合能力(t=15.42,P=0.0001)=L27K601A促進(jìn)的幾乎都是膜的全融合,其內(nèi)膜的融合比L27WT增加了40%,而L27L602A則大部分為外膜的融合。 結(jié)論： HIV-1gp41loop疏水中心區(qū)域二硫鍵之間的601位為親水性的堿性殘基賴氨酸,其并非是膜外部分決定loop結(jié)構(gòu)和功能的唯一因素,但是能夠平衡loop區(qū)域的的疏水性和極性,從而幫助gp41loop在融合進(jìn)入過程的每一步驟中保持正確的結(jié)構(gòu),同時在膜的外側(cè)發(fā)生氧化反應(yīng),并且引導(dǎo)膜上脂質(zhì)體的結(jié)合。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R512.91

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本文編號：1999465