本文選題：白念珠菌 + 口腔上皮細(xì)胞　； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：念珠菌是臨床常見的機(jī)會(huì)性致病真菌,其中白念珠菌是引起人體口腔及陰道等部位黏膜感染的主要念珠菌。眾所周知,口腔及陰道部位的黏膜上皮細(xì)胞是抵抗念珠菌感染的“第一道防線”。前期研究發(fā)現(xiàn),上皮細(xì)胞抵抗白念珠菌感染主要通過激活炎性信號(hào)通路(如ERK/JUK/p38等信號(hào)通路)、釋放炎性細(xì)胞因子等發(fā)揮免疫功能。鑒于臨床上口腔念珠菌病更易發(fā)生在免疫低下的病人、更易造成系統(tǒng)播散感染,但陰道念珠菌病更易發(fā)生在免疫正常女性、少見系統(tǒng)播散感染,故不同部位的上皮細(xì)胞可能存在不同的抗白念珠菌感染的機(jī)制。白念珠菌胞壁成分ALS3及SSA1與黏附功能有關(guān),在誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生抗念珠菌免疫的過程中起到重要的作用。前期已有研究證明敲除ALS3可降低誘導(dǎo)口腔上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子及炎性信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。但卻很少有實(shí)驗(yàn)研究ALS3敲除對(duì)陰道上皮細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的影響及可能涉及到的炎性通路。也很少有實(shí)驗(yàn)研究SSAl敲除對(duì)上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的影響及可能涉及到的炎性通路。本實(shí)驗(yàn)主要研究白念珠菌感染口腔上皮細(xì)胞及陰道上皮細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生及ERK信號(hào)通路蛋白激活的分子機(jī)制的差異,同時(shí)探討白念珠菌胞壁成分AIs3蛋白、Ssa1蛋白在此免疫過程中存在的可能作用機(jī)制。第一章 口腔和陰道上皮細(xì)胞抗白念珠菌感染的免疫差異目的：探索口腔上皮細(xì)胞及陰道上皮細(xì)胞體外感染白念珠菌免疫反應(yīng)的異同性。方法：口腔上皮細(xì)胞(leuk-1)、陰道上皮細(xì)胞(VK2/E6E7)進(jìn)行體外培養(yǎng),給予白念珠菌(SC5314)不同菌量的感染。觀察不同部位來(lái)源的上皮細(xì)胞在非感染及白念珠菌感染狀態(tài)下免疫效應(yīng)分子及通路蛋白表達(dá)的異同,檢測(cè)白念珠菌感染不同上皮細(xì)胞時(shí),其細(xì)胞毒性、炎性細(xì)胞因子分泌及p-ERK1/2、p-MKP1蛋白表達(dá)的差異。結(jié)果：口腔和陰道上皮細(xì)胞,在體外培養(yǎng)的形態(tài)上存在很多共性：倒置顯微鏡下見鋪路石樣外觀,多角形,大小不一,形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞核呈圓形或卵圓形。細(xì)胞經(jīng)過瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液染色后,都可呈現(xiàn)出較為典型的細(xì)胞質(zhì)粉紅色,細(xì)胞核藍(lán)(黑)色的表現(xiàn)。生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果,口腔leuk-1細(xì)胞與陰道VK2/E6E7細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖過程存在差異,Leuk-1細(xì)胞的增殖速度較VK2/E6E7細(xì)胞快；兩組細(xì)胞在生長(zhǎng)增殖的過程中細(xì)胞直徑呈現(xiàn)出類似“拋物線”形狀的變化圖；但leuk-1細(xì)胞直徑整體仍較VK2/E6E7細(xì)胞偏大。白念珠菌感染狀態(tài)下,死亡細(xì)胞沿菌絲分布。細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,同一種細(xì)胞的損傷度與白念珠菌感染的菌量及感染時(shí)間有關(guān),即損傷度與白念珠菌菌量、時(shí)間成正比。兩組細(xì)胞對(duì)比,白念珠菌對(duì)不同上皮細(xì)胞的損傷具有特異性：同一菌量感染狀態(tài)下,白念珠菌對(duì)陰道上皮細(xì)胞VK2/E6E7的損傷較重,而對(duì)口腔上皮細(xì)胞leuk-1的損傷較輕。炎性細(xì)胞因子的檢測(cè)顯示：白念珠菌在口腔上皮細(xì)胞與陰道上皮細(xì)胞中均可刺激誘導(dǎo)GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、RANTES、MIP-3α、IL-8的分泌量增多,但亦存在一定差異,口腔上皮細(xì)胞在未感染狀態(tài)時(shí)可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,在低劑量白念珠菌感染時(shí)即可產(chǎn)生較多的分泌量；而陰道上皮細(xì)胞在未感染時(shí),多數(shù)因子分泌量極少,即使在白念珠菌感染后,多數(shù)細(xì)胞因子的分泌量仍增幅不大。兩種細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞因子最大誘導(dǎo)量的白念珠菌刺激菌量不同。在口腔感染過程中, IL-8、GM-CSF、MIP-3α及RANTES的分泌高峰出現(xiàn)在白念珠菌感染菌量／細(xì)胞量(MOI)=0.01時(shí),G-CSF、IL-1β的分泌高峰出現(xiàn)在MOI=0.1時(shí),IL-1 α的分泌高峰出現(xiàn)在MOI=1時(shí)。而陰道上皮細(xì)胞在感染過程中,IL-8βGM-CSF的分泌高峰出現(xiàn)在MOI=0.01時(shí),G-CSF的分泌高峰出現(xiàn)在MOI=0.1,而IL-1α、IL-1β及MIP-3α的分泌高峰出現(xiàn)在MOI=1時(shí)。IL-4及IL-12兩種細(xì)胞因子,未顯示明顯的白念珠菌劑量依賴性或是規(guī)律性的趨勢(shì)。在白念珠菌感染口腔和陰道上皮細(xì)胞2h后,分別檢測(cè)其p-ERK1/2及p-MKP1蛋白的表達(dá)情況,顯示白念SC5314感染組的p-ERK1/2及p-MKP1蛋白的表達(dá)都較對(duì)照組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論：白念珠菌感染口腔和陰道這兩種不同部位上皮細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞損傷及炎性細(xì)胞因子的含量并不相同,上皮細(xì)胞抗白念珠菌的免疫應(yīng)答存在部位差異性。第二章 白念珠菌ALS3敲除株感染口腔和陰道上皮細(xì)胞后免疫學(xué)機(jī)制的比較研究目的：探索白念珠菌ALS3基因在白念珠菌刺激口腔上皮細(xì)胞及陰道上皮細(xì)胞產(chǎn)生抗白念珠菌免疫反應(yīng)的過程中的作用,及其存在的可能的免疫機(jī)制差異。方法：體外分別培養(yǎng)口腔上皮細(xì)胞和陰道上皮細(xì)胞,給予白念珠菌SC5314(WT株)及白念珠菌ALS3敲除株(als3△)不同菌量的感染。測(cè)定白念珠菌WT株及als3△株分別感染不同上皮細(xì)胞時(shí),其細(xì)胞毒性、炎性細(xì)胞因子及ERK1/2、MKP1通路蛋白的表達(dá),對(duì)比不同菌量、不同菌株、不同來(lái)源細(xì)胞的免疫反應(yīng)的差異。結(jié)果：白念珠菌ALS3基因敲除后,其菌絲的生長(zhǎng)不受影響,與SC5314野生株比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。但對(duì)比WT及als3△感染上皮細(xì)胞的結(jié)果,als3△對(duì)細(xì)胞的損傷明顯降低(p0.05),且其細(xì)胞損傷程度呈劑量依賴型,即MOI值越大,損傷也越大。als3△感染口腔上皮細(xì)胞后,GM-CSF、G-CSF、,IL-1α、IL-1β、MIP-3α和IL-8細(xì)胞因子的產(chǎn)生量均較WT感染組降低(p0.05)。als3△感染陰道上皮細(xì)胞后,除了RANTES及MIP-3 a外的其他細(xì)胞因子,都較WT組降低(p0.05)。對(duì)比分析WT株分別感染兩種不同來(lái)源上皮細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生G-CSF、RANTES、MIP-3 α、IL-8的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)口腔上皮細(xì)胞leuk-1組這些細(xì)胞因子的產(chǎn)量高于陰道細(xì)胞VK2/E6E7組(p0.05)；而als3△感染時(shí),兩組細(xì)胞間上述細(xì)胞因子的產(chǎn)量并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)�？谇簧掀ぜ�(xì)胞分別感染白念珠菌WT與als3△ 2h后,WT感染組與als3△感染組中p-ERK1/2蛋白的表達(dá)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);但WT感染組中p-MKP1蛋白的表達(dá)量高于als3△感染組的表達(dá)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。在陰道上皮細(xì)胞VK2/E6E7分別感染白念珠菌WT與als3△的蛋白檢測(cè)中,WT感染組p-ERK1/2蛋白及p-MKP1蛋白的表達(dá)量均較als3△感染組的表達(dá)量高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論：白念珠菌ALS3基因的表達(dá)可以誘導(dǎo)口腔上皮細(xì)胞和陰道上皮細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子。且als3△刺激兩組細(xì)胞產(chǎn)生某些炎性細(xì)胞因子的能力有一定的差異。在白念珠菌感染口腔上皮細(xì)胞誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的過程中,A1s3蛋白不完全通過激活ERK免疫信號(hào)通路增強(qiáng)p-MKP1蛋白的表達(dá)來(lái)參與免疫反應(yīng),而在白念珠菌感染陰道上皮細(xì)胞的過程中,Als3蛋白通過激活ERK通路誘導(dǎo)p-MKP1蛋白的表達(dá)增強(qiáng)來(lái)參與免疫反應(yīng)。表明口腔上皮細(xì)胞及陰道上皮細(xì)胞在應(yīng)對(duì)白念珠菌Als3蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中,存在部位性差異。第三章 白念珠菌SSA1敲除株感染口腔和陰道上皮細(xì)胞后免疫學(xué)機(jī)制的比較研究目的：探討白念珠菌SSAl基因表達(dá)在刺激口腔上皮細(xì)胞及陰道上皮細(xì)胞產(chǎn)生抗白念珠菌免疫效應(yīng)過程中的作用。方法：體外培養(yǎng)口腔、陰道上皮細(xì)胞,分別用白念珠菌SC5314(WT)及白念珠菌SSAl基因敲除株(ssa1△)進(jìn)行刺激。測(cè)定不同菌量刺激兩種不同上皮細(xì)胞時(shí)在細(xì)胞損傷、炎性細(xì)胞因子分泌、通路蛋白p-ERK1/2及p-MKP1表達(dá)的變化。對(duì)比不同組別間的差異,分析可能存在的機(jī)制。結(jié)果：體外培養(yǎng)白念珠菌SSAl敲除株,2h后測(cè)量菌絲長(zhǎng)度較WT株明顯縮短(p0.05)。ssa1△在感染上皮細(xì)胞24h后無(wú)法形成菌落,只有散在的菌絲,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞染色后,可見死亡細(xì)胞沿菌絲分布。對(duì)比WT感染上皮細(xì)胞的結(jié)果,ssa1△損傷細(xì)胞的能力降低,但也可通過提高感染菌量而加大損傷。WT與ssal△分別感染口腔上皮細(xì)胞,ssal△感染組的GM-CSF、IL-1α、IL-1β、 RANTES、MIP-3α、IL-8的分泌量均較WT感染組降低(p0.05)。WT與ssal△分別感染陰道上皮細(xì)胞時(shí),ssa1△感染組在G-CSF、IL-1 α、MIP-3 α、IL-8細(xì)胞因子的產(chǎn)生量降低,與WT感染組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。白念珠菌WT株感染兩種不同來(lái)源的上皮細(xì)胞時(shí),口腔上皮細(xì)胞組IL-1β、RANTES、 MIP-3 α、IL-8的分泌量比陰道上皮細(xì)胞組高(p0.05)。而在ssa1△感染兩種細(xì)胞時(shí),兩組細(xì)胞上述細(xì)胞因子產(chǎn)生量的對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)�？谇簧掀ぜ�(xì)胞分別感染白念珠菌WT與ssa1△株2h后檢測(cè)通路蛋白,WT感染組p-ERK12及p-MKP1蛋白表達(dá)量較ssa1A感染組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。在陰道上皮細(xì)胞分別感染W(wǎng)T與ssal△的蛋白檢測(cè)中,白念珠菌WT感染組p-ERK12蛋白及p-MKP1蛋白的表達(dá)量均較ssa1△感染后的表達(dá)量高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論：白念珠菌SSA1基因與白念珠菌菌絲延長(zhǎng)的功能有關(guān)。SSA1基因的敲除,降低了白念珠菌對(duì)上皮細(xì)胞的損傷,也降低了白念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞及陰道上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生及信號(hào)通路的激活�？谇簧掀ぜ�(xì)胞及陰道上皮細(xì)胞在應(yīng)對(duì)白念珠菌Ssa1蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中,存在部位性差異。小結(jié)：白念珠菌感染口腔上皮細(xì)胞及陰道上皮細(xì)胞時(shí),兩種不同來(lái)源的上皮細(xì)胞激發(fā)的免疫效應(yīng)并不相同,其所分泌炎癥效應(yīng)因子及ERK炎癥通路蛋白表達(dá)方面存在差異,這可能是口腔、陰道兩部位抗白念珠菌結(jié)果差異的機(jī)制之一。通過敲除白念珠菌胞壁成分基因ALS3、SSA1的菌株,分別感染口腔上皮細(xì)胞及陰道上皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)敲除后的菌株感染可以降低細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子及通路蛋白表達(dá),還可消除兩種細(xì)胞存在的部分差異,故白念珠菌ALS3、SSA1基因表達(dá)對(duì)誘導(dǎo)口腔及陰道上皮細(xì)胞抗白念珠菌感染免疫反應(yīng)的發(fā)生,有重要作用；對(duì)口腔、陰道兩部位抗白念珠菌感染免疫差異的發(fā)生也有重要作用,此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為口腔念珠菌感染及陰道念珠菌感染的防治工作研究提供更多的理論依據(jù)。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of cell wall components AIs3 and SSA1 on the expression of inflammatory cytokines and inflammatory cytokines in epithelial cells .
The cell diameters of the two groups were similar to those of the " parabola " shape during the growth and proliferation .
The results of cell damage experiment showed that the injury degree of the same kind of cells was related to the infection time of Candida albicans , that is , the injury degree was proportional to the amount and time of Candida albicans infection .
The expression of IL - 8 , IL - 1尾 and MIP - 3偽 in the oral and vaginal epithelial cells of Candida albicans was higher than that in the control group . The expression of IL - 8 , IL - 1尾 and MIP - 3偽 in the infected oral and vaginal epithelial cells was significantly higher than that in the control group . The results showed that the production of these cytokines in the leuk - 1 group was higher than that in VK2 / E6E7 group ( p < 0.05 ) .
The results showed that the expression of p - 1 / 2 protein and p - MKP1 protein in oral epithelial cells and vaginal epithelial cells was significantly shorter than that in als3 鈻，

本文編號(hào)：1997298