本文選題：弓形蟲 + 宿主細(xì)胞��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：一.研究背景剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲,幾乎可以感染溫血?jiǎng)游锏乃杏泻思?xì)胞,其終宿主為貓,而中間宿主從人類到鳥類分布極其廣泛。它是引起人獸共患的弓形蟲病的病原體,全球約有三分之一的人口隱性感染了弓形蟲。弓形蟲是一類機(jī)會(huì)性的致病原蟲,免疫機(jī)能正常的個(gè)體感染弓形蟲后可由急性感染轉(zhuǎn)為隱性感染,因而大多數(shù)感染者未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀；而對于免疫功能低下的個(gè)體,如器官移植患者、艾滋病人等,感染弓形蟲后弓形蟲則可在其體內(nèi)發(fā)生快速增殖進(jìn)而引起嚴(yán)重的組織損傷及相應(yīng)的臨床癥狀,如腦炎、弓形蟲眼病、淋巴結(jié)炎等,嚴(yán)重者甚至危及生命。婦女孕期感染弓形蟲后弓形蟲可通過胎盤傳給胎兒,進(jìn)而導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、畸胎和新生兒弓形蟲病的發(fā)生。弓形蟲入侵宿主細(xì)胞機(jī)制及其與宿主細(xì)胞間的相互作用機(jī)制目前已被廣泛研究。它入侵宿主細(xì)胞后寄居于一個(gè)非融合小室——納蟲泡(parasitophorous vacuole)內(nèi),納蟲泡膜為弓形蟲免受宿主細(xì)胞清除提供了保護(hù)屏障,弓形蟲在納蟲泡內(nèi)依靠宿主細(xì)胞提供的營養(yǎng)物質(zhì)迅速增長繁殖并破壞宿主細(xì)胞,最終從已遭破壞的宿主細(xì)胞中逸出并立即侵入鄰近的細(xì)胞,如此往復(fù)。在弓形蟲入侵、寄居、破壞及離開宿主細(xì)胞這一過程中,宿主細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)發(fā)生了廣泛的變化。磷酸化/去磷酸化是蛋白翻譯后修飾的重要方式之一,蛋白的磷酸化/去磷酸化的發(fā)生往往伴隨著蛋白活性的獲得或失去,而這一過程主要依靠蛋白激酶(Protein kinase, PK)催化蛋白質(zhì)的含羥基氨基酸(絲/蘇和酪)的側(cè)鏈羥基形成磷酸酯以及蛋白質(zhì)磷酸酯酶(Protein phosphatase, PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯鍵水解而完成。由于這一過程伴隨著蛋白活性的改變,生物體內(nèi)蛋白的磷酸化/去磷酸化扮演著分子開關(guān)的作用,普遍地參與到了細(xì)胞各個(gè)生物學(xué)過程的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控中。正因?yàn)榈鞍琢姿峄?去磷酸化是細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控中心且在細(xì)胞信號(hào)傳遞過程中廣泛存在并擔(dān)負(fù)著重要作用,因此本次研究以弓形蟲入侵之后的宿主細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)為切入點(diǎn),研究了弓形蟲入侵這一事件對宿主細(xì)胞的各細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的綜合影響情況。目前對于弓形蟲和宿主細(xì)胞之間相互作用的研究,主要研究方向有基因組測序及基因芯片分析,在蛋白水平上也有針對感染后宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)組定量分析的相關(guān)研究,而從翻譯后磷酸化修飾水平方面進(jìn)行的研究目前主要集中在以下幾方面：針對弓形蟲抗凋亡機(jī)制的研究；弓形蟲感染后炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究；弓形蟲自身ROP蛋白與弓形蟲毒力的關(guān)系以及其與宿主細(xì)胞蛋白相互作用的研究等。但這些針對蛋白磷酸化水平的研究都較為局限和分散,原因之一可歸結(jié)于技術(shù)水平所限導(dǎo)致難以實(shí)驗(yàn)對磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行高通量的有效的分析。近些年來SILAC技術(shù)的發(fā)展及其與高效反向液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的聯(lián)合使用使得高通量分析磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)成為可能。SILAC (Stable isotope labeling with amino acid in cell culture)即細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)。其原理為分別用含有輕、中、重型同位素標(biāo)記的必須氨基酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,則新合成的蛋白質(zhì)含有不同重量的同一種氨基酸,培養(yǎng)一定代數(shù)后幾乎所有的蛋白均被同位素標(biāo)記上。不同組的蛋白等量混合后進(jìn)行胰酶酶切處理,酶解后的肽段進(jìn)段進(jìn)行液相分離,之后上質(zhì)譜分析,一級(jí)質(zhì)譜圖中不同組的同種肽段會(huì)呈現(xiàn)出肽段群,通過比較同位素肽段群的峰面積大小進(jìn)行相對定量。一級(jí)質(zhì)譜中的磷酸化肽段的鑒定是通過與肽段理論值進(jìn)行比較,相差80Da (HPO3=80Da)的質(zhì)譜峰被選入進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,肽段破碎出現(xiàn)98Da的中性丟失則可進(jìn)一步確定其發(fā)生了磷酸化,同時(shí)亦可測定出中性丟失的位點(diǎn)即確定磷酸化發(fā)生的位點(diǎn)。二級(jí)譜圖對肽段進(jìn)行序列測定結(jié)合數(shù)據(jù)庫的搜索從而對蛋白進(jìn)行鑒定。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究過程中的另一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)則是對磷酸化蛋白進(jìn)行富集,近些年來金屬氧化物親和富集技術(shù)引起了越來越多研究者的關(guān)注。Ti02與磷酸肽上磷酸基團(tuán)具有高度的親和能力,在對磷酸化肽段富集時(shí)的選擇性和靈敏度方面都優(yōu)于先前較為流行的IMAC(固相金屬親和色譜)技術(shù),故本次研究選用了Ti02柱來完成了對磷酸化肽段的富集。以上技術(shù)使得在本次研究中完成對宿主細(xì)胞磷酸化蛋白的富集及精確的定量分析成為了可能。二.研究目的弓形蟲入侵宿主細(xì)胞是一個(gè)涉及到吸附、伴隨著納蟲泡的形成入侵到細(xì)胞內(nèi)、汲取宿主細(xì)胞營養(yǎng)完成自身生長及繁殖和逸出舊宿主細(xì)胞侵染鄰近新宿主細(xì)胞這樣一個(gè)連續(xù)的過程。這一過程不同的時(shí)間點(diǎn)對宿主細(xì)胞的影響側(cè)重點(diǎn)有所不同,如其感染宿主細(xì)胞早期可表現(xiàn)出宿主細(xì)胞抗凋亡的作用,而在感染晚期則往往導(dǎo)致了宿主細(xì)胞的崩解和死亡。為了研究弓形蟲感染宿主細(xì)胞早期和晚期宿主細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的各自變化情況,本次研究分別設(shè)置了對照組(無弓形蟲感染)、早期感染組(弓形蟲侵染2小時(shí))和晚期感染組(弓形蟲感染6小時(shí)),來對比分析弓形蟲侵染宿主細(xì)胞這一事件在感染早期和晚期對宿主細(xì)胞細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響分別側(cè)重于哪些細(xì)胞生物進(jìn)程。三.研究方法1.用SILAC對HFFs細(xì)胞蛋白進(jìn)行標(biāo)記本研究采用碳元素同位素12C和13C以及氮元素的同位素14N和15N進(jìn)行精氨酸和賴氨酸的標(biāo)記。L組為L-Lysine-2HCL和L-Arginine-HCL, M組為13C6L-Arginine-HCL和13C6L-Lysine-2HCL,H組為13C615N2 L-Lysine-2HCL和13C615N4 L-Arginine-HCL。HFF細(xì)胞分別用此三種培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)六代以后,每組獲得八個(gè)大平皿的細(xì)胞,收集兩個(gè)大平皿(D15)細(xì)胞送檢標(biāo)記率。標(biāo)記率檢測結(jié)果合格,至此細(xì)胞標(biāo)記完成。2.樣品的制備收集體外細(xì)胞培養(yǎng)所得的RH株弓形蟲速殖子,按照10：1的比例平均加入到H組和M組各自的六個(gè)平皿中。M組侵染2小時(shí)后停止侵染,收集細(xì)胞。H組侵染2小時(shí)后,洗脫游離細(xì)胞外的弓形蟲,繼續(xù)加入SILAC-H培養(yǎng)基讓細(xì)胞內(nèi)的弓形蟲繼續(xù)侵染4小時(shí),之后停止侵染,收集細(xì)胞。L組細(xì)胞不被弓形蟲侵染,直接收集細(xì)胞。3.磷酸化肽段的分離、富集及質(zhì)譜分析提取各組細(xì)胞的總蛋白后取三組細(xì)胞的蛋白進(jìn)行1：1：1等量混合,用Trypsin Gold (protein:trpsin=20:1)37℃消化4小時(shí)后,按同樣比例再加入Trypsin Gold繼續(xù)無間斷消化8小時(shí)。酶解后所得的肽段利用陽離子交換液相色譜柱SCX進(jìn)行分離,將所得到的不同餾分過Ti02柱進(jìn)行磷酸化肽段的富集。之后再將分離開的磷酸化及非磷酸化肽段上NanoLC-MS/MS Plateform及Triple TOF 5600 System質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行分析。4.質(zhì)譜信息的數(shù)據(jù)庫的搜索選取IPI human(91464 sequences)和ToxoDB-release-9.0數(shù)據(jù)庫,利用ProteinPilot v4.0對所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索及鑒定。對所鑒定出的磷酸化肽段、磷酸化蛋白信息,利用David Bioinformatics Resources, STRING (version 9.1), Molecule Annotation System,及Cytoscape等生物信息學(xué)軟件做進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析。四.實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.蛋白鑒定結(jié)果本次實(shí)驗(yàn)共鑒定出5593條肽段,其中3415條發(fā)生了磷酸化,共有2020個(gè)磷酸化位點(diǎn)；共鑒定到1293個(gè)宿主蛋白,其中發(fā)生磷酸化的蛋白數(shù)為967個(gè)。2020個(gè)磷酸化位點(diǎn)中有1869個(gè)發(fā)生在絲氨酸上,149個(gè)發(fā)生在蘇氨酸上,2個(gè)發(fā)生在酪氨酸上。2.不同實(shí)驗(yàn)組的定量蛋白比較將本次實(shí)驗(yàn)中差異倍數(shù)大于1.5且p-value小于等于0.05的磷酸化肽段定義為顯著差異磷酸化肽段。本次實(shí)驗(yàn)測得M組對比L組中,總共有450個(gè)顯著差異性的磷酸化肽段,其中267個(gè)磷酸化水平上調(diào),183個(gè)磷酸化水平下調(diào),總共對應(yīng)到301個(gè)磷酸化蛋白上；H組對比L組中,總共測得354個(gè)顯著差異性磷酸化肽段,其中193個(gè)磷酸化水平上調(diào),161個(gè)磷酸化水平下調(diào),總共對應(yīng)到249個(gè)磷酸化蛋白上；H組對比M組共檢測到425個(gè)顯著差異性磷酸化肽段,其中181個(gè)磷酸化水平上調(diào)244個(gè)磷酸化水平下調(diào),總共對應(yīng)到288個(gè)磷酸化蛋白上。3.對所鑒定到的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析對所鑒定到的967個(gè)磷酸化蛋白統(tǒng)一做GO分析以及將三組兩兩比較所得的顯著差異性蛋白分別做GO分析可發(fā)現(xiàn),這些蛋白在生物學(xué)過程上排首位的為細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)、在細(xì)胞組分上排首位的為細(xì)胞組分(cell part)、分子功能上排首位的為結(jié)合(binding)。從三組數(shù)據(jù)比較所得細(xì)胞組件的GO富集信息來看,M/L特異性富集在細(xì)胞核(pore complex; nuclear envelope)相關(guān)上,H/M組特異性富集在線粒體(mitochondrial part; mitochondrial envelope; mitochondrial membrane)、細(xì)胞核(nucleoplasm)及細(xì)胞骨架(intermediate filament)上,H/L組特異性富集在細(xì)胞骨架(cytoskeleton part; cell cortex; microtubule cytoskeleton)上；分子功能的GO術(shù)語在M/L組中未出現(xiàn)特異性的富集,H/M組特異性的富集在酶結(jié)合(enzyme binding)上,H/L組則特異性富集在細(xì)胞骨架結(jié)合(actin filament binding)上；生物學(xué)過程方面,M/L組未出現(xiàn)特異性的富集,H/M組特異性富集在RNA剪接(nuclear mRNA splicing, via splicesome; RNA slicing, via transesterification reaction; RNA Splicing,viatransesterification reactions with bulged adenosine as nucleophile)及細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)(cytoskeleton organization)上,H/L組特異性富集在細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)(regulation of cytoskeleton organization; negative regulation of cytoskeleton organization; regulation of Microtubule-based process) 及轉(zhuǎn)錄 (regulation of transcription factor activity; negative regulation of transcription factor activity)相關(guān)上。對于蛋白進(jìn)行COG分析可得,對于三組對比的特異性蛋白而言,所占比例最高的分類為R類(General function prediction only);對H/L而言,排名第二的為L類(Replication, recombination and repai),緊跟著K類(Transciption)和T類(Signal transduction mechanisms);對于M/L而言排名第二的COG為K類(Transcription),緊跟著的為L類(Replication, recombination and repair);而對于H/M而言,排名第二的為L類(Replication, recombination and repair)和T類(Signal transduction mechanisms),緊跟著K類(Transciption)。H/L組的磷酸化顯著差異性蛋白中沒有Ⅰ類(Lipid transport and metabolism)蛋白；而在M/L組的磷酸化顯著差異性蛋白中沒有N類(Cell motility)蛋白；在H/M組中,則沒有F類(Nucleotide transport and metabolism)和H類(Coenzyme transport and metabolism)蛋白。對所鑒定到的蛋白做KEGG分析,M/L的磷酸化顯著差異性蛋白總共參與到了97個(gè)通路中,其中P值0.05的通路有21個(gè)；H/L磷酸化顯著差異蛋白總共參與到了87個(gè)通路中,其中P值0.05的通路有14個(gè)；KEGG分析顯示,H/M磷酸化顯著差異性蛋白總共參與到了95個(gè)通路中,其中P值0.05的通路有18個(gè)。對比以上三組間比較的KEGG分析,在三組對比中均出現(xiàn)的KEGG過程有細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、內(nèi)吞作用、黏著斑、縫隙連接、MAPK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、Notch細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核苷酸剪切修復(fù)、細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)和剪接體。最后利用MAS3.0及Cytoscape等軟件對各組顯著差異性蛋白做了蛋白與蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖及蛋白-通路網(wǎng)絡(luò)圖。五.討論本研究通過胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)成功地對HFFs細(xì)胞進(jìn)行了同位素標(biāo)記,利用SILAC技術(shù)聯(lián)合高效反向液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)成功地對不同處理后的宿主細(xì)胞進(jìn)行了磷酸化蛋白的分離和高通量的鑒定,成功地鑒定到各組中的磷酸化蛋白、磷酸化肽段及磷酸化位點(diǎn)。通過各種生物信息學(xué)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后,成功地對這些蛋白所參與到的KEGG通路、COG分類、其參加的生物學(xué)過程、分子功能及細(xì)胞定位進(jìn)行了分析和歸納總結(jié),通過對比不同處理組間的結(jié)果,對弓形蟲感染細(xì)胞早期和晚期其對宿主細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所帶來的不同影響提供了初步的提示信息。對鑒定到的蛋白所進(jìn)行的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析則為后續(xù)的相關(guān)研究者提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R531.8

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;科研[J];醫(yī)藥世界;2004年06期

2 陳穎盈;侯連生;;盤基網(wǎng)柄菌——研究致病機(jī)制的宿主模型[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2007年01期

3 楊倩;;病原菌入侵宿主細(xì)胞的機(jī)制研究進(jìn)展[J];免疫學(xué)雜志;2010年02期

4 謝兆輝;;病毒RNA如何逃避宿主細(xì)胞的降解[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2013年02期

5 劉挺,管遠(yuǎn)志;內(nèi)在化的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2003年07期

6 王瑞卿;;H和N是什么意思[J];科技術(shù)語研究;2006年02期

7 楊倩;;病原菌與宿主細(xì)胞中的微絲裝配[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2010年01期

8 李晨瀟;黃新華;何思為;王德成;;病原體調(diào)控宿主細(xì)胞周期致病機(jī)制的研究進(jìn)展[J];微生物與感染;2011年01期

9 田博,丁志芬;Vero細(xì)胞疫苗生產(chǎn)過程中宿主細(xì)胞蛋白含量分析[J];中國生物制品學(xué)雜志;2005年05期

10 張士猛;王升啟;;乙型肝炎病毒與宿主細(xì)胞蛋白相互作用的研究進(jìn)展[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2006年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 韓黎;紀(jì)蕾;蘇文莉;王菡;梁克為;胡小華;;磷脂酶D影響李斯特菌感染宿主細(xì)胞效率的初步研究[A];2006中國微生物學(xué)會(huì)第九次全國會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2006年

2 黃碧海;林毅;張志凌;專芳芳;劉安安;田智全;張振鋒;王漢中;龐代文;;借助宿主細(xì)胞對包膜病毒的表面包膜進(jìn)行標(biāo)記[A];中國化學(xué)會(huì)第28屆學(xué)術(shù)年會(huì)第3分會(huì)場摘要集[C];2012年

3 答亮;唐紅;毛怡;雷垠瑞;楊佳麗;趙慕鈞;;HBV X蛋白增強(qiáng)宿主細(xì)胞自吞噬的機(jī)制研究[A];北方遺傳資源的保護(hù)與利用研討會(huì)論文匯編[C];2010年

4 賈偉;Catalin Doneanu;Keith Fadgen;陳熙;宋蘭坤;StJohn Skilton;Martha Stapels;;液質(zhì)聯(lián)用法鑒定、定量蛋白藥物中宿主細(xì)胞蛋白[A];2012年中國藥學(xué)大會(huì)暨第十二屆中國藥師周論文集[C];2012年

5 常維山;翟靜;宋文剛;劉永慶;;宿主細(xì)胞內(nèi)SARS-CoV N蛋白相互作用蛋白的篩選與鑒定[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

6 陳艾媛;魏海霞;彭鴻娟;;弓形蟲利用宿主細(xì)胞資源合成磷酸化蛋白的研究[A];2013年全國寄生蟲學(xué)與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2013年

7 方彩云;易志剛;劉鋒;劉清平;陸豪杰;袁正宏;楊們原;;HCV亞基因組復(fù)制細(xì)胞中脂筏蛋白質(zhì)組研究[A];中國蛋白質(zhì)組學(xué)第三屆學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要[C];2005年

8 張峰;仲飛;李秀錦;王幸興;張考;陳慧慧;李振;李文艷;潘紅麗;韓冬梅;;重組豬肺表面活性蛋白A在體外可抑制PRRSV感染宿主細(xì)胞[A];全國動(dòng)物生理生化第十二次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2012年

9 榮成博;高福;;G-細(xì)菌粘附的分子機(jī)制—假結(jié)核耶爾森氏菌粘附的分子基礎(chǔ)[A];2010年中國科學(xué)院微生物研究所博士后學(xué)術(shù)年會(huì)暨第二屆博誼論壇論文摘要集[C];2011年

10 饒進(jìn)軍;徐偉;吳曙光;;導(dǎo)入外源性P53基因?qū)L1520復(fù)制的影響[A];中國藥理學(xué)會(huì)第八次全國代表大會(huì)暨全國藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2002年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 何屹;科學(xué)家揭秘病毒如何感染宿主細(xì)胞[N];科技日報(bào);2010年

2 岳陽;宿主細(xì)胞可限制艾滋病病毒復(fù)制[N];中國醫(yī)藥報(bào);2012年

3 記者 毛黎;病毒能欺騙宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)自我復(fù)制[N];科技日報(bào);2007年

4 編譯 文執(zhí);科學(xué)家追尋致病微生物的足跡[N];科技日報(bào);2002年

5 趙永新 趙穎t，

本文編號(hào)：1953741