本文選題：弓形蟲 + 宿主細胞��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：一.研究背景剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內寄生的原蟲,幾乎可以感染溫血動物的所有有核細胞,其終宿主為貓,而中間宿主從人類到鳥類分布極其廣泛。它是引起人獸共患的弓形蟲病的病原體,全球約有三分之一的人口隱性感染了弓形蟲。弓形蟲是一類機會性的致病原蟲,免疫機能正常的個體感染弓形蟲后可由急性感染轉為隱性感染,因而大多數(shù)感染者未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀；而對于免疫功能低下的個體,如器官移植患者、艾滋病人等,感染弓形蟲后弓形蟲則可在其體內發(fā)生快速增殖進而引起嚴重的組織損傷及相應的臨床癥狀,如腦炎、弓形蟲眼病、淋巴結炎等,嚴重者甚至危及生命。婦女孕期感染弓形蟲后弓形蟲可通過胎盤傳給胎兒,進而導致流產(chǎn)、死胎、畸胎和新生兒弓形蟲病的發(fā)生。弓形蟲入侵宿主細胞機制及其與宿主細胞間的相互作用機制目前已被廣泛研究。它入侵宿主細胞后寄居于一個非融合小室——納蟲泡(parasitophorous vacuole)內,納蟲泡膜為弓形蟲免受宿主細胞清除提供了保護屏障,弓形蟲在納蟲泡內依靠宿主細胞提供的營養(yǎng)物質迅速增長繁殖并破壞宿主細胞,最終從已遭破壞的宿主細胞中逸出并立即侵入鄰近的細胞,如此往復。在弓形蟲入侵、寄居、破壞及離開宿主細胞這一過程中,宿主細胞內部的細胞信號轉導網(wǎng)絡發(fā)生了廣泛的變化。磷酸化/去磷酸化是蛋白翻譯后修飾的重要方式之一,蛋白的磷酸化/去磷酸化的發(fā)生往往伴隨著蛋白活性的獲得或失去,而這一過程主要依靠蛋白激酶(Protein kinase, PK)催化蛋白質的含羥基氨基酸(絲/蘇和酪)的側鏈羥基形成磷酸酯以及蛋白質磷酸酯酶(Protein phosphatase, PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯鍵水解而完成。由于這一過程伴隨著蛋白活性的改變,生物體內蛋白的磷酸化/去磷酸化扮演著分子開關的作用,普遍地參與到了細胞各個生物學過程的細胞信號轉導的調控中。正因為蛋白磷酸化/去磷酸化是細胞生命活動的調控中心且在細胞信號傳遞過程中廣泛存在并擔負著重要作用,因此本次研究以弓形蟲入侵之后的宿主細胞磷酸化蛋白質組學為切入點,研究了弓形蟲入侵這一事件對宿主細胞的各細胞信號轉導網(wǎng)絡的綜合影響情況。目前對于弓形蟲和宿主細胞之間相互作用的研究,主要研究方向有基因組測序及基因芯片分析,在蛋白水平上也有針對感染后宿主細胞的蛋白質組定量分析的相關研究,而從翻譯后磷酸化修飾水平方面進行的研究目前主要集中在以下幾方面：針對弓形蟲抗凋亡機制的研究；弓形蟲感染后炎癥信號轉導機制的研究；弓形蟲自身ROP蛋白與弓形蟲毒力的關系以及其與宿主細胞蛋白相互作用的研究等。但這些針對蛋白磷酸化水平的研究都較為局限和分散,原因之一可歸結于技術水平所限導致難以實驗對磷酸化蛋白質組進行高通量的有效的分析。近些年來SILAC技術的發(fā)展及其與高效反向液相色譜-質譜聯(lián)用技術的聯(lián)合使用使得高通量分析磷酸化蛋白質組學成為可能。SILAC (Stable isotope labeling with amino acid in cell culture)即細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記技術。其原理為分別用含有輕、中、重型同位素標記的必須氨基酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,則新合成的蛋白質含有不同重量的同一種氨基酸,培養(yǎng)一定代數(shù)后幾乎所有的蛋白均被同位素標記上。不同組的蛋白等量混合后進行胰酶酶切處理,酶解后的肽段進段進行液相分離,之后上質譜分析,一級質譜圖中不同組的同種肽段會呈現(xiàn)出肽段群,通過比較同位素肽段群的峰面積大小進行相對定量。一級質譜中的磷酸化肽段的鑒定是通過與肽段理論值進行比較,相差80Da (HPO3=80Da)的質譜峰被選入進行二級質譜分析,肽段破碎出現(xiàn)98Da的中性丟失則可進一步確定其發(fā)生了磷酸化,同時亦可測定出中性丟失的位點即確定磷酸化發(fā)生的位點。二級譜圖對肽段進行序列測定結合數(shù)據(jù)庫的搜索從而對蛋白進行鑒定。磷酸化蛋白質組學研究過程中的另一個技術難點則是對磷酸化蛋白進行富集,近些年來金屬氧化物親和富集技術引起了越來越多研究者的關注。Ti02與磷酸肽上磷酸基團具有高度的親和能力,在對磷酸化肽段富集時的選擇性和靈敏度方面都優(yōu)于先前較為流行的IMAC(固相金屬親和色譜)技術,故本次研究選用了Ti02柱來完成了對磷酸化肽段的富集。以上技術使得在本次研究中完成對宿主細胞磷酸化蛋白的富集及精確的定量分析成為了可能。二.研究目的弓形蟲入侵宿主細胞是一個涉及到吸附、伴隨著納蟲泡的形成入侵到細胞內、汲取宿主細胞營養(yǎng)完成自身生長及繁殖和逸出舊宿主細胞侵染鄰近新宿主細胞這樣一個連續(xù)的過程。這一過程不同的時間點對宿主細胞的影響側重點有所不同,如其感染宿主細胞早期可表現(xiàn)出宿主細胞抗凋亡的作用,而在感染晚期則往往導致了宿主細胞的崩解和死亡。為了研究弓形蟲感染宿主細胞早期和晚期宿主細胞內細胞信號網(wǎng)絡的各自變化情況,本次研究分別設置了對照組(無弓形蟲感染)、早期感染組(弓形蟲侵染2小時)和晚期感染組(弓形蟲感染6小時),來對比分析弓形蟲侵染宿主細胞這一事件在感染早期和晚期對宿主細胞細胞信號轉導的影響分別側重于哪些細胞生物進程。三.研究方法1.用SILAC對HFFs細胞蛋白進行標記本研究采用碳元素同位素12C和13C以及氮元素的同位素14N和15N進行精氨酸和賴氨酸的標記。L組為L-Lysine-2HCL和L-Arginine-HCL, M組為13C6L-Arginine-HCL和13C6L-Lysine-2HCL,H組為13C615N2 L-Lysine-2HCL和13C615N4 L-Arginine-HCL。HFF細胞分別用此三種培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng),培養(yǎng)六代以后,每組獲得八個大平皿的細胞,收集兩個大平皿(D15)細胞送檢標記率。標記率檢測結果合格,至此細胞標記完成。2.樣品的制備收集體外細胞培養(yǎng)所得的RH株弓形蟲速殖子,按照10：1的比例平均加入到H組和M組各自的六個平皿中。M組侵染2小時后停止侵染,收集細胞。H組侵染2小時后,洗脫游離細胞外的弓形蟲,繼續(xù)加入SILAC-H培養(yǎng)基讓細胞內的弓形蟲繼續(xù)侵染4小時,之后停止侵染,收集細胞。L組細胞不被弓形蟲侵染,直接收集細胞。3.磷酸化肽段的分離、富集及質譜分析提取各組細胞的總蛋白后取三組細胞的蛋白進行1：1：1等量混合,用Trypsin Gold (protein:trpsin=20:1)37℃消化4小時后,按同樣比例再加入Trypsin Gold繼續(xù)無間斷消化8小時。酶解后所得的肽段利用陽離子交換液相色譜柱SCX進行分離,將所得到的不同餾分過Ti02柱進行磷酸化肽段的富集。之后再將分離開的磷酸化及非磷酸化肽段上NanoLC-MS/MS Plateform及Triple TOF 5600 System質譜聯(lián)用進行分析。4.質譜信息的數(shù)據(jù)庫的搜索選取IPI human(91464 sequences)和ToxoDB-release-9.0數(shù)據(jù)庫,利用ProteinPilot v4.0對所得質譜數(shù)據(jù)進行搜索及鑒定。對所鑒定出的磷酸化肽段、磷酸化蛋白信息,利用David Bioinformatics Resources, STRING (version 9.1), Molecule Annotation System,及Cytoscape等生物信息學軟件做進一步的生物信息學分析。四.實驗結果1.蛋白鑒定結果本次實驗共鑒定出5593條肽段,其中3415條發(fā)生了磷酸化,共有2020個磷酸化位點；共鑒定到1293個宿主蛋白,其中發(fā)生磷酸化的蛋白數(shù)為967個。2020個磷酸化位點中有1869個發(fā)生在絲氨酸上,149個發(fā)生在蘇氨酸上,2個發(fā)生在酪氨酸上。2.不同實驗組的定量蛋白比較將本次實驗中差異倍數(shù)大于1.5且p-value小于等于0.05的磷酸化肽段定義為顯著差異磷酸化肽段。本次實驗測得M組對比L組中,總共有450個顯著差異性的磷酸化肽段,其中267個磷酸化水平上調,183個磷酸化水平下調,總共對應到301個磷酸化蛋白上；H組對比L組中,總共測得354個顯著差異性磷酸化肽段,其中193個磷酸化水平上調,161個磷酸化水平下調,總共對應到249個磷酸化蛋白上；H組對比M組共檢測到425個顯著差異性磷酸化肽段,其中181個磷酸化水平上調244個磷酸化水平下調,總共對應到288個磷酸化蛋白上。3.對所鑒定到的蛋白進行生物信息學分析對所鑒定到的967個磷酸化蛋白統(tǒng)一做GO分析以及將三組兩兩比較所得的顯著差異性蛋白分別做GO分析可發(fā)現(xiàn),這些蛋白在生物學過程上排首位的為細胞進程(cellular process)、在細胞組分上排首位的為細胞組分(cell part)、分子功能上排首位的為結合(binding)。從三組數(shù)據(jù)比較所得細胞組件的GO富集信息來看,M/L特異性富集在細胞核(pore complex; nuclear envelope)相關上,H/M組特異性富集在線粒體(mitochondrial part; mitochondrial envelope; mitochondrial membrane)、細胞核(nucleoplasm)及細胞骨架(intermediate filament)上,H/L組特異性富集在細胞骨架(cytoskeleton part; cell cortex; microtubule cytoskeleton)上；分子功能的GO術語在M/L組中未出現(xiàn)特異性的富集,H/M組特異性的富集在酶結合(enzyme binding)上,H/L組則特異性富集在細胞骨架結合(actin filament binding)上；生物學過程方面,M/L組未出現(xiàn)特異性的富集,H/M組特異性富集在RNA剪接(nuclear mRNA splicing, via splicesome; RNA slicing, via transesterification reaction; RNA Splicing,viatransesterification reactions with bulged adenosine as nucleophile)及細胞骨架調節(jié)(cytoskeleton organization)上,H/L組特異性富集在細胞骨架調節(jié)(regulation of cytoskeleton organization; negative regulation of cytoskeleton organization; regulation of Microtubule-based process) 及轉錄 (regulation of transcription factor activity; negative regulation of transcription factor activity)相關上。對于蛋白進行COG分析可得,對于三組對比的特異性蛋白而言,所占比例最高的分類為R類(General function prediction only);對H/L而言,排名第二的為L類(Replication, recombination and repai),緊跟著K類(Transciption)和T類(Signal transduction mechanisms);對于M/L而言排名第二的COG為K類(Transcription),緊跟著的為L類(Replication, recombination and repair);而對于H/M而言,排名第二的為L類(Replication, recombination and repair)和T類(Signal transduction mechanisms),緊跟著K類(Transciption)。H/L組的磷酸化顯著差異性蛋白中沒有Ⅰ類(Lipid transport and metabolism)蛋白；而在M/L組的磷酸化顯著差異性蛋白中沒有N類(Cell motility)蛋白；在H/M組中,則沒有F類(Nucleotide transport and metabolism)和H類(Coenzyme transport and metabolism)蛋白。對所鑒定到的蛋白做KEGG分析,M/L的磷酸化顯著差異性蛋白總共參與到了97個通路中,其中P值0.05的通路有21個；H/L磷酸化顯著差異蛋白總共參與到了87個通路中,其中P值0.05的通路有14個；KEGG分析顯示,H/M磷酸化顯著差異性蛋白總共參與到了95個通路中,其中P值0.05的通路有18個。對比以上三組間比較的KEGG分析,在三組對比中均出現(xiàn)的KEGG過程有細胞周期、DNA復制、內吞作用、黏著斑、縫隙連接、MAPK細胞信號轉導、Notch細胞信號轉導、核苷酸剪切修復、細胞骨架肌動蛋白調節(jié)和剪接體。最后利用MAS3.0及Cytoscape等軟件對各組顯著差異性蛋白做了蛋白與蛋白相互作用的網(wǎng)絡圖及蛋白-通路網(wǎng)絡圖。五.討論本研究通過胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記技術成功地對HFFs細胞進行了同位素標記,利用SILAC技術聯(lián)合高效反向液相色譜—質譜聯(lián)用技術成功地對不同處理后的宿主細胞進行了磷酸化蛋白的分離和高通量的鑒定,成功地鑒定到各組中的磷酸化蛋白、磷酸化肽段及磷酸化位點。通過各種生物信息學分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析后,成功地對這些蛋白所參與到的KEGG通路、COG分類、其參加的生物學過程、分子功能及細胞定位進行了分析和歸納總結,通過對比不同處理組間的結果,對弓形蟲感染細胞早期和晚期其對宿主細胞信號轉導所帶來的不同影響提供了初步的提示信息。對鑒定到的蛋白所進行的蛋白相互作用網(wǎng)絡分析則為后續(xù)的相關研究者提供了一定的實驗基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R531.8

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本文編號：1953741