本文選題：旋毛蟲 + LAMP��； 參考：《鄭州大學》2016年博士論文

【摘要】：旋毛蟲病(Trichinellosis)是一種較為嚴重的人獸共患寄生蟲病,主要因宿主生食或半生食了含有旋毛蟲幼蟲囊包的肉類引起。該病地理分布廣泛,在過去的兩個世紀里,全球許多地區(qū)有旋毛蟲病暴發(fā)流行的報道,被稱為再度肆虐的感染性疾病。旋毛蟲是組織內(nèi)寄生線蟲,目前主要采用傳統(tǒng)病原學診斷方法,但肌肉活檢及尸體膈肌壓片鏡檢的相關調(diào)查數(shù)據(jù)較少,對各地人群旋毛蟲病患病率的評估很困難。血清學檢查雖然可行,但有諸多不足,如價格較貴、抗體檢測存在窗口期、與其他寄生蟲病易發(fā)生交叉反應等,往往需要做更昂貴的免疫印跡實驗。目前核酸分子檢測技術的應用日趨廣泛,隨著檢測成本的降低,檢測過程更加標準化和自動化,此類技術將越來越多地應用于寄生蟲病的早期診斷、現(xiàn)場快速檢測及流行病學調(diào)查等各個方面。環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated Isothermal Amplification,簡稱LAMP),是日本學者Notomi發(fā)明的一種體外核酸等溫擴增技術,這種技術需要特殊設計的4~6條引物來特異性識別目標片段,在具有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下在很短的時間內(nèi)擴增靶序列,同時產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂,可通過濁度的變化來直接判斷陰陽性結果。因此具有特異、快速、高效、簡便的特點。本論文將LAMP技術應用于旋毛蟲感染小鼠不同組織樣本中旋毛蟲DNA的快速檢測,研發(fā)了旋毛蟲LAMP快速檢測試劑盒,使其更適宜于現(xiàn)場和基層醫(yī)療單位的旋毛蟲快速檢測。以前的研究表明,PCR法檢測血液中旋毛蟲DNA具有一定的早期診斷價值。而本研究過程中通過建立高、中、低3種不同劑量旋毛蟲感染小鼠模型,收集感染早期階段的肌肉、血液、糞便樣本進行LAMP檢測,驗證了該方法的高度敏感性和特異性,特別是對于肌肉中幼蟲密度非常低時,該技術更突顯其重要的檢測和診斷價值。本論文研究證明LAMP法比PCR法更敏感、快速、簡便,有望在提高人及動物旋毛蟲病的早期診斷,旋毛蟲病的現(xiàn)場檢測、肉類檢疫及流行病學調(diào)查等領域發(fā)揮更大作用。材料和方法1旋毛蟲蟲種、實驗動物、基因組DNA的提取本實驗所用的蟲種,旋毛蟲河南豬源株(Trichinella spiralis,T1),北方旋毛蟲(T.nativa,T2)、偽旋毛蟲(T.pseudospiralis,T4)、南方旋毛蟲(納氏旋毛蟲,T.nelsoni,T7),來自國際旋毛蟲參考中心(International Trichinella Reference Centre,ITRC)本實驗室昆明小鼠傳代保種。其他人體寄生蠕蟲標本,包括似蚓蛔線蟲、蟯蟲、鞭蟲、十二指腸鉤口線蟲、華支睪吸蟲、布氏姜片蟲、日本血蟲、豬帶絳蟲、牛帶絳蟲、曼氏迭宮絳蟲,均由本實驗室保存。6w齡健康雄性昆明小鼠(SPF級),體重20g~25g,購買并飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。旋毛蟲及其他樣本基因組DNA的提取采用天根公司的血液/組織/糞便基因組DNA提取試劑盒。2 LAMP引物設計及最佳引物篩選靶基因為NCBI Gen Bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上公開的旋毛蟲1.6kb重復DNA序列(Gen Bank:X06625.1),將其Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)特異性比對。選用Primer Explorer V4設計軟件(EIKEN CHEMICAL CO.,LTD,Tochigi,Japan)設計引物(http://primerexplorer.jp/e/),共設計出16套引物,以旋毛蟲的基因組DNA為模板,在相同的條件下進行LAMP擴增,篩選最佳引物。3 LAMP法檢測旋毛蟲特異性評價以旋毛蟲(T1)、鄉(xiāng)土旋毛蟲(T2)、偽旋毛蟲(T4)、納氏旋毛蟲(T7)基因組DNA作為陽性對照,雙蒸水為陰性對照,其他10種人體寄生蟲(似蚓蛔線蟲、鞭蟲、蟯蟲、十二指腸鉤口線蟲、布氏姜片蟲、華支睪吸蟲、日本血吸蟲、豬帶絳蟲、牛帶絳蟲、曼氏迭宮絳蟲)的基因組DNA為特異性對照進行LAMP反應,用實時濁度儀和鈣黃綠素顏色反應兩種方法檢測結果。4 LAMP法檢測旋毛蟲核酸濃度的敏感性及與PCR法的比較為驗證篩選出的最佳引物的敏感性,并與PCR法的敏感性相比較,提取100條旋毛蟲肌肉幼蟲基因組DNA,經(jīng)核酸定量后以10倍梯度進行稀釋,DNA的濃度范圍為3,620 ng/μl至3.62 fg/μl,每個LAMP反應中加入2μl的DNA模板,LAMP法進行敏感性評價。同時以TS2F3和TS2B3為引物,以相同濃度的旋毛蟲DNA為模板,PCR法進行敏感性評價。5 LAMP法檢測單條旋毛蟲幼蟲的敏感性及與PCR法的比較提取10條旋毛蟲肌幼蟲基因組DNA,定容于1ml的PBS溶液中,以10倍梯度稀釋,使?jié)舛确秶喈斢诿?ml PBS溶液中含10~0.00001條幼蟲DNA,每個LAMP反應中加入2μl的DNA模板。用LAMP法和PCR法進行敏感性評價。6旋毛蟲不同模擬樣本核酸提取方法的比較評價DNA提取試劑盒和Chelex法提取旋毛蟲肌肉、血液、糞便模擬樣本基因組DNA的效果。分別將1條旋毛蟲肌幼蟲加入50μl健康小鼠血液,200mg健康小鼠糞便,250mg健康小鼠肌肉組織,分別用天根公司的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒和Chelex裂解液提取基因組DNA進行LAMP檢測,評價兩種方法提取的單條旋毛蟲DNA模板的擴增效率。7評價封閉劑對LAMP反應和鈣黃綠素顯色效果的影響檢測封閉劑是否影響LAMP反應及鈣黃綠素的顯色效果,將熔點為42℃的精煉固態(tài)石蠟融化后導入模具,制成直徑與反應管相同的柱狀固態(tài)石蠟塊,設計6組對照實驗比較添加或不添加石蠟及鈣黃綠素對LAMP反應的影響。8 LAMP試劑盒檢測小鼠肌肉中旋毛蟲DNA(1)將10條旋毛蟲肌幼蟲加入1g健康小鼠肌肉組織,充分研磨后提取基因組DNA,以10倍梯度進行稀釋,使?jié)舛确秶喈斢诿?g肌肉組織中含10~0.00001條幼蟲,每個反應加入2μl的DNA模板,用LAMP法和PCR法評價肌肉模擬樣本的敏感性。(2)6w齡健康雄性昆明小鼠18只,隨機分成3組,每組6只,用灌胃法感染旋毛蟲。組Ⅰ:陰性對照組;組Ⅱ:每只小鼠感染10條肌幼蟲;組Ⅲ:每只小鼠感染50條肌幼蟲;LAMP法檢測感染后第20d的小鼠肌肉樣本。9 LAMP試劑盒檢測小鼠血液中旋毛蟲DNA6w齡健康雄性昆明小鼠15只,隨機分成3組,每組5只,用灌胃法感染旋毛蟲。每組小鼠分別感染10條、100條、300條肌肉幼蟲,建立低、中、高度感染小鼠動物模型。感染后第1d~20d每天采集每只小鼠尾靜脈血50μl,每天5個血液樣本,共300個樣本提取基因組DNA進行LAMP檢測。10 LAMP試劑盒檢測小鼠糞便中旋毛蟲DNA6w齡健康雄性昆明小鼠15只,隨機分成3組,每組5只,用灌胃法感染旋毛蟲。每組小鼠分別感染10條、100條、300條肌幼蟲,感染后第1d~20d每組小鼠每天采集糞便樣本,分成4份樣本,共240個樣本提取基因組DNA進行LAMP檢測。11統(tǒng)計分析使用軟件SPSS 17.0對血液、糞便樣本的LAMP檢測數(shù)據(jù)進行卡方檢驗統(tǒng)計分析,檢驗水平為α=0.05。結果1最佳引物篩選通過對靶序列Blast比對,旋毛蟲1.6kb DNA重復序列具有很好的特異性,根據(jù)該序列共設計了16套引物,在相同的條件下進行LAMP擴增,15套可以擴增出靶基因,尤其添加了環(huán)引物后擴增效率提高了1/3,其中TS2套引物最先發(fā)生LAMP反應,且擴增效率最高,作為最佳引物進行下一步的實驗。2特異性實驗只有陽性對照組旋毛蟲(T1)、鄉(xiāng)土旋毛蟲(T2)、偽旋毛蟲(T4)、納氏旋毛蟲(T7)的基因組DNA作為模板時發(fā)生LAMP擴增,而陰性對照組其他10余種人體寄生蠕蟲的基因組DNA和水作為模板時均沒有發(fā)生擴增。實時濁度儀和鈣黃綠素顏色反應兩種方法檢測結果一致,實驗說明TS2套引物具有很好的屬特異性。3 LAMP法檢測旋毛蟲核酸濃度的敏感性及與PCR法的比較LAMP法可檢測到DNA的最低濃度為362 fg/μl,以TS2F3和TS2B3為引物,PCR反應產(chǎn)物是225bp大小的擴增條帶,經(jīng)測序為目的片段。PCR法檢測到的最低濃度為3.62 pg/μl,因此LAMP法比PCR法的敏感性高出10倍以上。4 LAMP法檢測單條旋毛蟲的敏感性及與PCR法的比較LAMP法檢測單條旋毛蟲肌幼蟲的靈敏性為0.001條/ml,PCR法的靈敏性為0.01條/ml,驗證了LAMP法比PCR法敏感性高出10倍以上結論。5旋毛蟲樣本不同核酸提取方法的比較用天根公司的血液/組織/糞便基因組DNA提取試劑盒和Chelex裂解液提取含1條幼蟲的血液、糞便、肌肉模擬樣本DNA,經(jīng)LAMP檢測均為陽性,兩種方法提取的DNA模板的擴增效率差異不顯著。6評價封閉劑的影響加封閉劑組與不加封閉劑組的LAMP檢出時間不變,顯示封閉劑不抑制LAMP擴增效率;加鈣黃綠素組的封閉劑對LAMP檢出時間不變,顯示封閉劑不抑制添加了鈣黃綠素的LAMP擴增效率。7 LAMP試劑盒檢測小鼠肌肉中旋毛蟲DNA(1)LAMP法檢測每克肌肉組織含10條幼蟲的DNA,最低可檢測到0.01條/g,PCR法為0.1條/g,可見LAMP法比PCR法的敏感性高出10倍以上。(2)分別感染10條、50條肌幼蟲組第20d的小鼠肌肉樣本,2組LAMP檢測均為陽性結果,檢出率為100%(6/6),未感染組小鼠肌肉樣本均為陰性結果。8 LAMP試劑盒檢測小鼠血液中旋毛蟲DNA(1)為LAMP檢測小鼠輕度感染(10條幼蟲)組1d~20dpi的血液樣本,每天5份樣本,共100份樣本,最早于第9dpi的樣本中檢測到旋毛蟲特異DNA,第9d、10d、13d、18d~20dpi每天的陽性率為20%(1/5);第15d、17dpi每天的陽性率為40%(2/5)。(2)LAMP檢測小鼠中度感染(100條幼蟲)組1d~20dpi的血液樣本,每天5份樣本,共100份樣本,最早于第1dpi的樣本中檢測到旋毛蟲特異DNA,第1d、3d、11d、12d、15dpi每天的陽性率為20%(1/5);第7d、8d、10d、17d、19d、20dpi每天的陽性率為40%(2/5)。(3)LAMP檢測小鼠重度感染(300條幼蟲)組1d~20dpi的血液樣本,每天5份樣本,共100份樣本,最早于第3dpi的樣本中檢測到旋毛蟲特異DNA,第4d、5d、9d、13d、14d、16d、20dpi每天的陽性率為20%(1/5),第3dpi的陽性率為40%(2/5),第8d、10d、11d、19dpi的陽性率為60%(3/5),第15dpi的陽性率為80%(4/5)。(4)3組不同感染度小鼠LAMP陽性率間的差異沒有統(tǒng)計學意義(c(17)=4.899,P=0.086),LAMP檢測血液樣本的陽性率與感染程度沒有相關性。輕度感染小鼠不同天數(shù)間的LAMP檢測陽性率差異無統(tǒng)計學意義(c(17)=20.000,P=0.395);中度感染小鼠不同天數(shù)間的LAMP陽性率差異無統(tǒng)計學意義(c(17)=23.459,P=0.218);高度感染小鼠不同天數(shù)間的LAMP陽性率差異有統(tǒng)計學意義(c(17)=31.393,P=0.037)。當輕度感染時LAMP檢測陽性率與檢測時間沒有相關性,當重度感染時LAMP檢測陽性率與檢測時間有一定的相關性,第8d~15dpi檢出率較高。9 LAMP試劑盒檢測小鼠糞便中旋毛蟲DNA(1)LAMP檢測小鼠輕度感染組(10條幼蟲)第1d~20dpi的糞便樣本,每天4個樣本,共80份樣本,最早于第6dpi的樣本中檢測到旋毛蟲特異DNA,分別在第6~11d、13~19dpi的糞便樣本中檢測出陽性樣本;其中第6~10d、13~15d、17dpi每天的陽性率為25%(1/4),第11d、18d、19dpi每天的陽性率為50%(2/4)。(2)LAMP檢測小鼠中度感染(100條幼蟲)組1d~20dpi的糞便樣本,每天4個樣本,共80個樣本,最早于第2dpi的樣本中檢測到旋毛蟲特異DNA,分別在第2、4、5、7d、9~20dpi的糞便樣本中檢測出陽性樣本;其中第2d、4d、9d、11d、19d、20dpi每天的陽性率為25%(1/4),第10d、14d、18dpi每天的陽性率為50%(2/4),第5d、7d、12d、13d、15~17dpi每天的陽性率為75%(3/4)。(3)LAMP檢測小鼠重度感染(300條幼蟲)組1d~20dpi的糞便樣本,每天4個樣本,共80個樣本,最早于第2dpi的樣本中檢測到旋毛蟲特異DNA,分別在第2~20dpi的糞便樣本中檢測出陽性樣本;其中第2d、3d、6d、9d、18dpi每天的陽性率為25%(1/4),第5d、14d、19dpi每天的陽性率為50%(2/4),第4d、7d、8d、10d、13d、15d、16d、20dpi每天的陽性率為75%(3/4),第11d、12d、17dpi每天的陽性率為100%(4/4)。(4)3組小鼠LAMP陽性率間的差異具有統(tǒng)計學意義(c(17)=14.823,P=0.001),陽性率與感染劑量有相關性(rs=0.500,P0.001),陽性率隨感染劑量的增加而升高(F=20.492,P0.001)。輕度感染組不同天數(shù)間的陽性率差異無統(tǒng)計學意義(c(17)=15.761,P=0.673);中度感染組不同天數(shù)間的陽性率差異無統(tǒng)計學意義(c(17)=27.389,P=0.096);重度感染組不同天數(shù)間的陽性率差異無統(tǒng)計學意義(c(17)=27.389,P=0.096)�？梢钥闯鯨AMP檢測糞便樣本的陽性率與感染后檢測時間沒有相關性。結論1.本論文發(fā)明的旋毛蟲LAMP快速檢測試劑盒,可在60min內(nèi)完成反應。具有良好的敏感性和特異性。有望應用于旋毛蟲病的現(xiàn)場檢測、肉類檢疫及流行病學調(diào)查等領域。2.應用該試劑盒,對不同劑量旋毛蟲感染小鼠早期階段的肌肉、血液、糞便樣本進行檢測,可以在低劑量感染小鼠的早期各種來源的樣本中檢測到旋毛蟲DNA,具有較高的檢出率。3.LAMP試劑盒檢測旋毛蟲小鼠血液樣本的陽性率與感染程度沒有發(fā)現(xiàn)相關性。當輕度感染時陽性率與檢測時間沒有發(fā)現(xiàn)相關性,當重度感染時陽性率與檢測時間有相關性,第8d~15dpi檢出率較高。4.LAMP試劑盒檢測旋毛蟲小鼠糞便樣本的陽性率與感染程度有相關性,陽性率隨感染劑量的增加而升高,與感染后檢測時間沒有發(fā)現(xiàn)相關性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R532.14;R440

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本文編號：1951064