本文選題：乙型肝炎 + 慢性�。� 參考：《浙江大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究目的:IL-35是IL-12家族的新成員,是一種抑制性細胞因子,由IL-27β(EBI3)及IL-12α(p35)兩個亞基所組成。IL-35可以將初始型T細胞誘導(dǎo)成一種新型的調(diào)節(jié)性 T 細胞即 IL-35 誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性 T 細胞(Interleukin-35 induced regulatory Tcells,iTR35),iTR35主要通過分泌細胞因子IL-35發(fā)揮免疫抑制效應(yīng),與已發(fā)現(xiàn)的通過IL-10和TGF-β發(fā)揮作用的調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory Tcell,Treg)比較,抑制作用更強,持續(xù)時間更久,可以有效阻止炎癥的發(fā)生、發(fā)展,是誘導(dǎo)感染性耐受的關(guān)鍵因子。在慢性乙肝患者外周血中IL-35含量明顯增高,提示IL-35可能在HBV持續(xù)性感染的免疫致病機制中發(fā)揮作用,但IL-35對免疫系統(tǒng)抗HBV病毒過程的調(diào)控目前尚未明確。本文主要研究iTR35通過IL-35途徑抑制HBV特異性細胞免疫應(yīng)答的作用機制,并通過體外實驗探討IL-35對后續(xù)信號通路的激活作用,力求為治療慢性乙型肝炎病毒提供新的策略與方案。研究方法:1.研究對象篩選2013年2月～2015年6月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院門診及住院的慢性乙肝患者61例,均為未經(jīng)抗病毒治療患者。同時以42例健康人及21例慢性無癥狀HBV病毒攜帶者作為陰性對照。2.實驗方法(1)采用Ficoll淋巴細胞分離液對外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)進行分離;(2)CD4+及CD4-T淋巴細胞的分離采用免疫磁珠法;(3)分離后的CD4+T淋巴細胞經(jīng)非特異性磁珠CD3/28刺激活化六天后用流式檢測IL-35的兩條蛋白鏈(EBI3及p35)在CD4+T淋巴細胞及CD4+CD25+細胞上的分布頻率;用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定CD4+T淋巴細胞內(nèi)IL-35的含量;(4)非特異性磁珠及特異性核心抗原結(jié)合不同濃度的IL-35刺激慢性乙肝患者CD4+T淋巴細胞24小時后流式檢測CD4+T細胞表面因子(CD25、CD45RA、CD45RO)的分布頻率變化;(5)非特異性磁珠結(jié)合不同濃度的IL-35刺激慢性乙型肝炎患者CD4+T細胞24小時后用ELISA法檢測CD4+T淋巴細胞上清中的IL-10分泌量;(6)HBV核心抗原重要表達肽段(peptide 18-27)結(jié)合不同濃度的IL-35刺激慢性乙肝患者PBMC 11天后用MHC-肽五聚體(pentamer)流式細胞技術(shù)測定HB V抗原(主要針對HBV重要表位肽段core18-27)特異性CD8+CTL數(shù)量;(7)慢性乙肝患者CD4-T淋巴細胞經(jīng)特異性抗原及不同濃度的IL-35刺激48小時后用酶聯(lián)斑點免疫吸附法(ELISPOT)測定分泌IFN--γ細胞的數(shù)量;(8)慢乙肝患者貼壁細胞(ACs)經(jīng)特異性抗原及不同濃度IL-35刺激24小時后收集細胞上清,用ELI SA法檢測IL-6的分泌情況;(9)慢乙患者PBMC經(jīng)特異性抗原及不同濃度IL-35刺激24小時后收集細胞,流式細胞技術(shù)檢測樹突狀細胞(DCs)表面標(biāo)志物:CD11c、CD86及HLA-DR;(10)CD4+T細胞經(jīng)IL-35刺激后的STAT1～STAT4信號通路利用激光共聚焦定位;(11)利用流式檢測IL-35刺激前后的轉(zhuǎn)錄因子STAT1～STAT4的含量變化判斷STAT1～STAT4信號通路有無被激活;(12)采用速率法對血清ALT及AST水平進行測定;采用比色法檢測血清總膽紅素;血清中HBV五項標(biāo)志物采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析(CMIA)技術(shù)檢測;血清中HBV DNA采用實時熒光實時定量PCR分析方法測定,測定值小于1×103 copies/ml為陰性;(13)結(jié)果所得數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包及GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析;研究結(jié)果:1、流式細胞術(shù)檢測慢性乙肝患者及正常人外周血CD4+ T淋巴細胞及CD4+CD25+ Tregs中IL-35兩條蛋白鏈EBI3及p35的含量:慢性乙肝患者CD4+ T細胞及Tregs中的EBI3表達含量較健康人均明顯增高(P0.001,P0.001),ELISA法測得慢性乙肝患者外周血CD4+T細胞經(jīng)刺激后IL-35含量較HBV攜帶者及正常人明顯升高(P=0.041,P=0.004);2、流式結(jié)果顯示EBI3在CD4+T細胞中的表達量與HBV DNA載量呈正相關(guān)(P=0.036,r=0.525),但與肝炎炎癥指標(biāo)如ALT、AST、TB等水平無關(guān)(P=0.275,r=0.291;P=0.378,r=0.236;P=0.336,r=0.257);3、HBV特異性核心抗原與不同濃度IL-35體外共刺激CD4+ T細胞可減少CD45RA在CD4+T細胞上的分布頻率:Ag+PBS(對照組):36.09±5.93%;Ag+IL-35(10ng/ml):32.75±6.24%;Ag+IL-35(40ng/ml):33.50±5.41%;Ag+IL-35(100ng/ml):32.23±5.43%。對照組與加入IL-35各組間P值均小于 0.05;4、非特異性磁珠CD3/28刺激CD4+ T細胞后ELISA法檢測CD4+ T細胞培養(yǎng)上清中的 IL-10分泌水平,CD3/28+PBS(對照組):128.3±36.5 ng/L;CD3/28+IL-35(10ng/ml):143.1±36.08 ng/L;CD3/28+IL-35(40ng/ml):155.5±36.14ng/L;CD3/28+IL-35(100ng/ml):160.8±32.75ng/L。對照組與加入IL-35組間P值均小于0.05;5、流式測HBV抗原特異性CD8+CTL五聚體(pentamer)分布頻率,可見與對照組(peptide+PBS)相比peptide+IL-35(100ng/ml)體外刺激后pentamer在CD8+T細胞上分布頻率明顯降低(1.631±0.436vs1.019±0.269,P=0.003);IL-35(1 Ong/ml)、(40ng/ml)與組對照組相比,雖可見下降趨勢,但統(tǒng)計結(jié)果無顯著差異(P=0.673,P=0.446);6、ELISPOT法檢測分泌IFN-γ的CTL數(shù)量:Ag+PBS(對照組):237±28,Ag+IL-35 SFU/well(10ng/ml):216±35 SFU/well;Ag+IL-35(40ng/ml):185±36SFU/well;Ag+IL-35(100ng/ml):170±36SFU/well。只加抗原組與IL-35(1Ong/ml)組相比未見明顯差別,但與IL-35(40ng/ml、1OOng/ml)相比可見顯著性差異(P=0.01,P=0007);7、ELISA法測ACs上清IL-6的分泌水平,兩組表達IL-6濃度如下:Ag+PBS(對照組):375.9±101.9 pg/ml;Ag+IL-35(100ng/ml):313.0±99.23 pg/ml。兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.002);8、流式檢測DC細胞表面標(biāo)志物,可見與對照組(Ag+PBS)相比,Ag+IL-35(1 00ng/ml)可抑制CD 11 c+細胞在PBMC中的分布頻率,Ag+PBS(對照組):10.10±3.65%;Ag+IL-35(100ng/ml):8.96±3.40%。兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.02);9、激光共聚焦可定位經(jīng)過IL-35刺激培養(yǎng)后的CD4+T細胞胞漿高表達STAT1及STAT4蛋白;10、流式結(jié)果可見加入IL-35(100ng/ml)可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子STAT1、STAT4的上調(diào),與未加IL-35組存在顯著性差異(P=0.019,P=0.029)。研究結(jié)論:1、IL-35在慢性乙肝患者外周血中高表達,且與慢性乙肝的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2、IL-35不僅可以明顯抑制HBV特異性CTL的增殖及其效應(yīng)分子IFN-γ分泌,還可抑制CD4+CD25-CD45RA+效應(yīng)T細胞及DCs的功能,并同時促進CD4+T細胞分泌免疫抑制因子,是影響慢性乙型肝炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。3、IL-35可以激活CD4+T細胞上的STAT1/STAT4信號通路,預(yù)示IL-35極有可能通過JAK/STAT通路抑制HBV效應(yīng)性T細胞增殖與分化。
[Abstract]:鐮旂┒鐩殑:IL-35鏄疘L-12瀹舵棌鐨勬柊鎴愬憳,鏄竴縐嶆姂鍒舵，

本文編號：1934036