本文選題：乙型肝炎病毒 + DC-SIGN��； 參考：《華中科技大學》2014年博士論文

【摘要】：目的： 探尋高爾基體α甘露糖苷酶I (Golgi M I)介導的HBV(乙型肝炎病毒)的去甘露糖修飾,是否能使病毒逃逸樹突狀細胞(DCs)表面DC-SIGN的免疫識別及其機制。將DC-SIGN基因沉默后,觀察DCs在野生型HBV或高甘露糖型HBV刺激下的免疫指標,研究野生型HBV與高甘露糖型HBV對DC的成熟和免疫活化的影響,以及DC-SIGN在HBV感染中發(fā)揮的免疫作用。在課題組既往實驗的基礎上,通過尋找可能存在于HBe功能蛋白基因序列中的促進宿主細胞Golgi M I活性的核心片段,來初步探討Golgi M I相關(guān)的HBV去甘露糖修飾,通過何種機制逃逸DC-SIGN對HBV的免疫識別及阻礙DCs免疫活化。 方法： 一、樹突狀細胞DC-SIGN的基因沉默及其對樹突狀細胞免疫功能的影響1.分離健康人的外周血單個核細胞(PBMC)進行體外培養(yǎng),以GM-CSF、白細胞介素-4(IL-4)和腫瘤壞死因子(TNF-α)將其誘導分化為DC； 2.構(gòu)建DC-SIGN基因沉默的siRNA序列,分組轉(zhuǎn)染DC細胞； 3. RT-PCR法檢測DC細胞內(nèi)DC-SIGNmRNA的表達,流式細胞術(shù)檢測DC細胞表面DC-SIGN的表達,選擇DC-SIGN沉默效果最好的序列進行后續(xù)試驗； 4.空白對照組、DC-SIGN基因沉默組與轉(zhuǎn)染無關(guān)siRNA序列組的DC細胞,以流式細胞術(shù)檢測表面分子CD80、CD83、CD86、CD1a、HLA-DR的表達; 5. ELISA法檢測4中所述三組DC細胞分泌細胞因子IL-10與IL-12p70的水平； 6.MTT法檢測4中所述三組DC細胞刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力； 7. Westernblot法檢測4中所述三組DC細胞內(nèi)NF-κB p65與p38的表達； 二、野生型與高甘露糖型HBV對DC-SIGN基因非沉默與沉默的樹突狀細胞免疫功能的影響 1.體外培養(yǎng)HepG2.2.15細胞； 2.加入基夫堿母液至HepG2.2.15細胞中,使基夫堿終濃度為5ug/ml,如此處理5天后收集HepG2.2.15培養(yǎng)上清液； 3.通過低溫超速離心法,從基夫堿處理的HepG2.2.15細胞提取獲得高甘露糖型HBV顆粒,從HepG2.2.15細胞提取獲得野生型HBV,并以熒光定量PCR法檢測HBV DNA滴度； 4.體外培養(yǎng)PBMC并誘導分化的DC分為DC-SIGN沉默與非沉默兩組,每組三個亞組：對照組、加野生型HBV組,加高甘露糖型HBV組。在DC培養(yǎng)第5天將收獲HBV顆粒(調(diào)整濃度為5×106copies/ml),加入到相應組的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至第7天時,進行如下檢測； 5.流式細胞術(shù)檢測上述6個亞組中DC細胞表面分子CD80、CD83、CD86、CD1a、 HLA-DR的表達 6. ELISA法檢測上述6個亞組中DC細胞分泌細胞因子IL-10與IL-12p70的水平； 7.MTT法檢測上述6個亞組中DC細胞刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力; 8. Westernblot法檢測上述6個亞組中DC細胞NF-κB p65與p38的表達； 三、HBe基因片段中促進Golgi M I活性的核心序列質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 1.取出本實驗室保存的采用分子克隆的方法構(gòu)建并鑒定過的HBe功能蛋白的真核表達載體(質(zhì)粒),分析表達的HBe蛋白結(jié)構(gòu)域； 2. Wingene軟件分析酶切位點,將HBe質(zhì)粒的基因序列切分為三段目的序列,分別在每段序列的上下游加入酶切位點Xho I, BamH I。設計各序列引物,PCR擴增,將目的片段連接載體pEGFP-N1,構(gòu)建分別包含三個表達HBe亞片段的真核表達載體,依次命名為HBe-1、HBe-2、HBe-3,分別進行測序鑒定; 3.將上述3種含HBe亞片段的質(zhì)粒和含HBe全長的質(zhì)粒分別經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染進入HepG2細胞內(nèi),設置空白對照組,用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細胞綠色熒光蛋白的表達； 4.RTPCR方法檢測轉(zhuǎn)染上述各質(zhì)粒后5組HepG2細胞Golgi M I的2種亞型基因MAN1A1、MAN1A2的mRNA表達水平； 5.Western blot檢測轉(zhuǎn)染上述各質(zhì)粒后5組HepG2細胞MAN1A1、MAN1A2的蛋白表達水平； 結(jié)果： 一、樹突狀細胞DC-SIGN的基因沉默及其對樹突狀細胞免疫功能的影響 1.成功選擇了能使DC表面DC-SIGN基因沉默的siRNA序列。 2.用siRNA沉默DC-SIGN,對以下指標無影響：DC表面CD1a、CD80、CD83、CD86、 HLADR的表達水平、DC細胞刺激同種異體淋巴細胞增殖能力、DC細胞IL-10及IL-12p70的分泌水平,以及DC細胞內(nèi)NF-κB p65與p38的表達水平。 二、野生型與高甘露糖型HBV對DC-SIGN基因非沉默與沉默的樹突狀細胞免疫功能的影響 1. DC-SIGN非基因沉默的亞組中,與高甘露糖型HBV干預的DC亞組相比,野生型HBV干預的DC亞組,細胞表面分子CD80、CD83、CD86、CD1a、HLA-DR的表達較低,細胞培養(yǎng)上清中IL-12p70的水平較低而IL-10的表達水平較高,細胞刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力較弱,細胞內(nèi)NF-κB p65與p38的表達水平較低; 2.在DC-SIGN基因沉默的三個亞組中,野生型HBV干預的DCs與高甘露糖型HBV干預DCs,上述指標無明顯差異； 3.不論是否進行DC-SIGN基因沉默,不論用野生型HBV或高甘露糖型HBV干預,與未用HBV干預的DC細胞相比,以HBV干預的DC,上述各指標表達均升高,具有明顯統(tǒng)計學差異； 三、HBe基因片段中促進Golgi M I活性的核心序列質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 1.成功構(gòu)建三種分別含有三段HBe亞片段多肽基因的真核表達載體,且成功地將此三種質(zhì)粒及含有HBe全長蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細胞； 2.轉(zhuǎn)染了表達HBe全長或片段多肽質(zhì)粒的HepG2細胞,不論轉(zhuǎn)染的是哪一種質(zhì)粒,與對照組相比,HepG2細胞MAN1A1mRNA的表達量上升；且除HBe-1組外,HepG2細胞MAN1A2mRNA的表達量也上升。 3.轉(zhuǎn)染了表達HBe全長或片段多肽質(zhì)粒的HepG2細胞,不論轉(zhuǎn)染的是哪一種質(zhì)粒,與對照組相比,MAN1A1蛋白、MAN1A2蛋白的表達量均上升； 4. HBe-2轉(zhuǎn)染入HepG2細胞后,其表達MAN1A1mRNA、MAN1A2mRNA及MAN1A1蛋白、MAN1A2蛋白的水平平均值,均最接近轉(zhuǎn)染HBe全長質(zhì)粒組HepG2細胞的水平；其中特別地,HBe-2轉(zhuǎn)染入HepG2細胞后,其表達MAN1A2蛋白的能力與HBe全長質(zhì)粒組無差異。 5.HBe-κ HBe-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞后,其表達MAN1A1mRNA、MAN1A2mRNA及MAN1A1蛋白、MAN1A2蛋白的水平,明顯低于HBe全長質(zhì)粒組的HepG2細胞。 結(jié)論： 1.siRNA對DC表面DC-SIGN進行基因沉默后,對DC細胞的免疫功能未觀察到明顯影響； 2. DC-SIGN識別HBV后可以促進DC的成熟和免疫活化,相比高甘露糖型HBV,野生型HBV能一定程度地逃逸DC-SIGN的識別,這種逃逸機制與Golgi M I參與的去甘露聚糖修飾有關(guān),并有可能導致DC的功能缺陷和HBV感染的慢性化, 3.所要尋找的促進Golgi M I活性的HBV基因片段的核心序列最有可能位于HBe-2質(zhì)粒片段中；但此核心序列發(fā)揮作用很可能需要其他片段的協(xié)同作用。
[Abstract]:Objective:
Explore whether the HBV (hepatitis B virus) mediated by the Golgi alpha manna glycosidase I (Golgi M I) modifies the mannose modification of the HBV (hepatitis B virus), and the immune recognition and mechanism of DC-SIGN on the surface of the virus escape dendritic cells (DCs). After the DC-SIGN gene is silenced, the immune index of DCs under the wild type HBV or high mannose type HBV stimuli is observed, and the wild type H is studied. The effects of BV and high mannose type HBV on the maturation and immune activation of DC and the immune function of DC-SIGN in HBV infection. On the basis of previous experiments in the subject group, the core fragment of the I activity of the host cell Golgi M that may exist in the sequence of the HBe functional protein gene was searched for the preliminary discussion of Golgi M I. The mechanism of mannose modification can escape the recognition of DC-SIGN by HBV and prevent DCs immune activation.
Method錛，

本文編號：1927452