本文選題：禽流感病毒 + 神經(jīng)氨酸酶　； 參考：《西北大學(xué)》2013年碩士論文

【摘要】：背景及意義：流感病毒神經(jīng)氨酸酶(也稱唾液酸酶,NA)：是位于流感病毒囊膜表面的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白,具外切糖苷酶活性,其作用是水解切除細胞表面甚至病毒自身糖蛋白糖鏈末端的唾液酸分子,以利于子代病毒的釋放。NA的糖基化可以保護NA蛋白避免宿主蛋白酶的攻擊,從而擴大病毒宿主范圍、增加病毒毒力。此外,糖基化的發(fā)生與變化對NA水解釋放唾液酸的能力亦有影響�，F(xiàn)在關(guān)于NA糖基化的研究較少,且一般集中在其糖基化位點研究,對NA糖鏈譜及糖鏈結(jié)構(gòu)的研究目前國內(nèi)外仍是空白。本實驗討論了禽流感病毒NA上糖鏈與其亞型、源性及致病性之間的關(guān)系,為禽流感的快速分型及監(jiān)測預(yù)警提供實驗依據(jù)；同時,繪制了NA的糖鏈結(jié)構(gòu)圖譜,以期為禽流感的治療提供新的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和潛在藥物靶點。 實驗及結(jié)果：本實驗第一部分中將NA特異的競爭性抑制劑4-氨基苯草氨酸作為親和配體,固定于環(huán)氧化磁性微粒表面,制備成對NA具有特異親和力的功能化磁性微粒,建立基于此種磁粒分離純化流感病毒NA的方法,優(yōu)化提取條件(磁粒用量,結(jié)合時間,洗脫時間)并進行特異性驗證。經(jīng)SDS-PAGE以及MALDI-TOF-MS技術(shù)鑒定,提取蛋白分子量與文獻報道一致。最后應(yīng)用該方法對實驗室現(xiàn)有8種毒株的NA進行分離純化,為本實驗后續(xù)研究提供材料。本實驗為流感病毒NA的分離純化提供了一種行之有效的手段,該方法操作簡便快捷、特異性高,對NA有著良好的提純效果,還可擴展應(yīng)用于其他復(fù)雜樣本中NA的提取。 本實驗第二部分對經(jīng)純化的8種病毒NA熒光標記后,應(yīng)用凝集素芯片技術(shù)進行檢測,在糖蛋白水平上得出各毒株NA上糖鏈的凝集素識別譜,由此對應(yīng)獲得其糖鏈譜的部分糖型信息,并通過數(shù)據(jù)分析及差異比對,發(fā)現(xiàn)NA糖鏈類型與病毒源性、NA亞型以及致病性之間均存在一定程度的關(guān)聯(lián)：(1)病毒源性與NA糖鏈類型之間的關(guān)系：以兩種高致病性H5N1流感病毒為例,其NA亞型與致病性均相同,源性上的差異表現(xiàn)為：凝集素PHA-E和Con A識別的糖鏈結(jié)構(gòu)在雞源毒株中相對高表達,LEL、RCA-120及SBA識別的糖鏈結(jié)構(gòu)在鴨源毒株中相對高表達；(2)在不同NA亞型N1型與N2型的比較中發(fā)現(xiàn)：無論是在雞源還是鴨源毒株中,N1型的NA表面,凝集素LCA識別的糖鏈結(jié)構(gòu)均相對高表達,而在N2型的NA上ACA識別的糖鏈結(jié)構(gòu)均相對高表達；(3)致病性與NA糖鏈類型之間的關(guān)系：將8種病毒按致病性高低分為兩組,雖每組的4種病毒其源性、NA亞型不盡相同,但其NA的糖鏈類型仍表現(xiàn)出一定的規(guī)律性：凝集素ECA識別的糖鏈結(jié)構(gòu)在且僅在4種高致病性毒株中被發(fā)現(xiàn)；ACA識別的糖鏈結(jié)構(gòu)的表達量在低致病性毒株中遠高于高致病性毒株。 本實驗第三部分借助濾膜和PNGase F酶,同時實現(xiàn)NA中N-糖鏈的釋放、糖鏈與蛋白的分離的雙重目的,經(jīng)親水柱Sepharose4B純化后,獲取實驗室現(xiàn)有8種毒株NA的全部糖鏈,利用MALDI-TOF/TOF-MS技術(shù)獲得其“糖鏈指紋圖譜”,并結(jié)合數(shù)據(jù)庫信息對糖鏈結(jié)構(gòu)進行解析,繪制出8種病毒NA的糖鏈結(jié)構(gòu)圖譜。從圖譜上可以看出,各毒株NA的糖鏈峰出峰位置相似,相對強度卻表現(xiàn)出明顯差異,其中有12個糖鏈峰共同存在。將每種病毒NA的所有糖鏈峰對應(yīng)的糖鏈結(jié)構(gòu)進行歸類,各毒株分別含有5-7種糖鏈類型不等。注釋結(jié)果顯示NA的糖鏈結(jié)構(gòu)具有微不均一性,可能存在不含有五糖核心結(jié)構(gòu)的直線型糖鏈結(jié)構(gòu)。且在各種來源的病毒NA中,均出現(xiàn)數(shù)據(jù)庫中注釋其來源為雞源的糖鏈,這與病毒均由雞胚增殖有關(guān)。
[Abstract]:Background and significance : Influenza virus neuraminic enzyme ( also called sialidase , NA ) : is a type 鈪，

本文編號：1915917