本文選題：旋毛蟲 + 排泄分泌蛋白��； 參考：《鄭州大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：旋毛蟲病(trichinellosis)主要因生食或半生食含有旋毛蟲(Trichinella)幼蟲的豬肉或其它動(dòng)物肉類而感染,是一種呈全球性分布的食源性人獸共患寄生蟲病。由于旋毛蟲病無(wú)特異性的癥狀和體征,因此,臨床上對(duì)本病不易進(jìn)行及時(shí)、正確的診斷。目前,該病的確診主要依靠肌肉活檢和高特異性的免疫學(xué)診斷方法,但前者取決于肌肉樣本的大小及感染程度,對(duì)于輕度和早期感染者往往不易檢出,即使感染晚期因取材局限陽(yáng)性率也只有50%左右,且不易被患者接受。在旋毛蟲感染的過(guò)程中,幼蟲的排泄分泌(excretory-secretory, ES)蛋白主要來(lái)自于桿狀體分泌顆粒,直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng),是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要靶抗原,可刺激宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),被國(guó)際旋毛蟲病委員會(huì)(International Conference on Trichinellosis, ICT)推薦用于ELISA或Western blotting檢測(cè)血清中的旋毛蟲抗體,但在旋毛蟲感染早期抗體檢出率較低,且與其他寄生蟲感染者之間存在一定的交叉反應(yīng)。本研究對(duì)旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白進(jìn)行雙向電泳(two dimensional gel electrophoresis,2-DE)、 Western blotting和質(zhì)譜分析,并對(duì)篩選出的旋毛蟲保護(hù)性抗體靶向抗原(antigen targeted by protective antibodies, ATPA, GenBank No. gi|404638)基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)及免疫學(xué)鑒定,并將其用于旋毛蟲實(shí)驗(yàn)感染小鼠和旋毛蟲病人血清特異性抗體的檢測(cè),對(duì)尋找旋毛蟲病免疫診斷候選抗原及研制高保護(hù)性旋毛蟲病疫苗具有一定的科學(xué)意義。 材料與方法 1旋毛蟲蟲種、血清與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本文所用蟲種為河南省南陽(yáng)豬源旋毛蟲(T1)由本實(shí)驗(yàn)室傳代保種。檢測(cè)血清包括鄉(xiāng)土旋毛蟲(T2)、布氏旋毛蟲(T3)、偽旋毛蟲(T4)、納氏旋毛蟲(T7)、裂頭蚴、弓形蟲與日本血吸蟲感染小鼠血清,以及旋毛蟲病人與其他寄生蟲病人血清。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為昆明小鼠和雌性BALB/c小鼠。 2應(yīng)用免疫蛋白組學(xué)篩選旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白中的早期診斷抗原 通過(guò)人工消化法和改良貝氏法收集純凈的旋毛蟲肌幼蟲,于體外培養(yǎng)后獲得其ES蛋白。將旋毛蟲肌幼蟲經(jīng)灌胃法感染BALB/c小鼠(300條/只),在感染后14～42天隔天進(jìn)行尾靜脈采血,分離血清,應(yīng)用肌幼蟲ES蛋白分別通過(guò)ELISA和Western blotting對(duì)感染小鼠血清中的旋毛蟲抗體進(jìn)行檢測(cè),將感染后最早出現(xiàn)旋毛蟲抗體的血清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白進(jìn)行2-DE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜,通過(guò)Western blotting應(yīng)用旋毛蟲感染早期抗體陽(yáng)性血清對(duì)旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白進(jìn)行識(shí)別,將陽(yáng)性反應(yīng)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。 3旋毛蟲ATPA基因的克隆、表達(dá)及鑒定 將旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白中分子量為30～40kDa、通過(guò)質(zhì)譜被成功鑒定的陽(yáng)性反應(yīng)蛋白點(diǎn)在2-DE凝膠和膠片上的灰度值及其比值分別進(jìn)行比較,從中選出比值最大的ATPA作為研究對(duì)象,應(yīng)用基因工程技術(shù)對(duì)旋毛蟲ATPA基因進(jìn)行分子克隆、表達(dá)和純化,將純化后的rATPA蛋白免疫BALB/c小鼠獲得其免疫血清,通過(guò)Western blotting分析其抗原性和免疫原性,應(yīng)用RT-PCR觀察ATPA基因在旋毛蟲不同發(fā)育期(成蟲、新生幼蟲、成囊前期幼蟲及成囊期幼蟲)是否轉(zhuǎn)錄；應(yīng)用間接免疫熒光抗體試驗(yàn)(IFT)對(duì)ATPA蛋白在旋毛蟲不同發(fā)育期的表達(dá)及其在蟲體組織的定位進(jìn)行分析。 4rATPA用于旋毛蟲感染小鼠與旋毛蟲病人血清抗體的檢測(cè) 應(yīng)用rATPA蛋白與肌幼蟲ES蛋白分別建立檢測(cè)旋毛蟲抗體IgG的rATPA-ELISA與ES-ELISA方法,分別用于檢測(cè)旋毛蟲T2、T3、T4和T7)感染小鼠及其他寄生蟲感染小鼠、旋毛蟲病人及其他寄生蟲病人血清抗體觀察rATPA-ELISA診斷旋毛蟲病的敏感性與特異性。將30只雌性6周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為重度(500條/只)、中度(300條/只)、輕度(100條/只)3個(gè)感染組(每組10只),應(yīng)用rATPA-ELISA與ES-ELISA同時(shí)對(duì)3組小鼠感染后2-42天的血清抗體進(jìn)行檢測(cè),觀察rATPA-ELISA對(duì)旋毛蟲感染早期及輕度感染的診斷價(jià)值。 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,采用卡方檢驗(yàn)和重復(fù)資料的方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析,檢驗(yàn)水平為α=0.05。 結(jié)果 1應(yīng)用免疫蛋白組學(xué)篩選旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白中的早期診斷抗原 應(yīng)用ELISA及Western blotting方法在小鼠感染旋毛蟲后18天可檢測(cè)出血清抗旋毛蟲抗體。分別將200μg和800μg旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白經(jīng)10%和12%凝膠進(jìn)行2-DE,可將分子量為40～60kDa和30～40kDa的蛋白進(jìn)行很好的分離,分別檢測(cè)到約33個(gè)和150個(gè)蛋白點(diǎn),轉(zhuǎn)印至PVDF膜后應(yīng)用旋毛蟲感染后18天的小鼠血清進(jìn)行Western blotting分析,發(fā)現(xiàn)有31個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)蛋白點(diǎn),分別經(jīng)胰酶消化后進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS分析,共鑒定出7種旋毛蟲蛋白,分別為：2種絲氨酸蛋白酶[serine proteases, SP1.2(gi|168805931)和SP1.3(gi|13641204, gi|168805933)]、DNase II (gi|339241449, gi|316974621)、2種假定的胰蛋白酶(putative trypsin, gi|339241891和gi|339241897)、保護(hù)性抗體靶向抗原(ATPA, gi|404638)及保守的假定蛋白(conserved hypothetical protein, gi|316966524)。對(duì)成功鑒定的已知功能的7種旋毛蟲蛋白進(jìn)行功能分類,7種旋毛蟲蛋白均具有催化和水解活性,且與代謝過(guò)程有關(guān)。 2ATPA基因的克隆、表達(dá)及鑒定 通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)ATPA基因進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)其不含跨膜區(qū),但含有信號(hào)肽序列(切割位點(diǎn)位于17～18位氨基酸殘基間),且具有良好的抗原性。通過(guò)RT-PCR獲得ATPA基因,并將其連接至表達(dá)載體pMAL-c2X,成功構(gòu)建了ATPA基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X-ATPA。對(duì)重組質(zhì)粒pMAL-c2X-ATPA進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在74kDa處出現(xiàn)一條明顯的蛋白帶(載體蛋白43kDa+目的蛋白31kDa),表明重組蛋白表達(dá)成功,可溶性分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白以可溶與包涵體2種形式表達(dá)。應(yīng)用Amylose樹(shù)脂預(yù)裝柱對(duì)表達(dá)的rATPA進(jìn)行純化,將純化后的rATPA蛋白免疫BALB/c小鼠獲得免疫血清,ELISA檢測(cè)rATPA免疫血清的效價(jià)為1：106。Western blotting結(jié)果顯示,rATPA可被旋毛蟲感染小鼠血清及rATPA免疫血清識(shí)別,rATPA免疫血清均可識(shí)別旋毛蟲肌幼蟲可溶性蛋白和ES蛋白的天然ATPA。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),ATPA基因在旋毛蟲4個(gè)發(fā)育期(成蟲、新生幼蟲、成囊前期幼蟲和成囊期幼蟲)均有轉(zhuǎn)錄；IFT結(jié)果顯示,ATPA蛋白在以上4個(gè)發(fā)育期均有表達(dá),且主要定位于蟲體表皮與桿狀體部位。 3rATPA用于旋毛蟲感染小鼠血清抗體的檢測(cè) 應(yīng)用rATPA-ELISA檢測(cè)T1、T2、T3、T4和T7感染小鼠的血清抗體陽(yáng)性率分別為96.67%(29/30)、90.00%(27/30)、93.33%(14/15)、40.91%(9/22)和93.75%(15/16),應(yīng)用ES-ELISA法檢測(cè)T1、T2、T3、T4和T7感染小鼠的血清抗體,分別為100%(30/30)、100%(30/30)、100%(15/15)、90.91%(20/22)和100%(16/16)；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明rATPA-ELISA與ES-ELISA檢測(cè)T1、T2、T3和T7感染小鼠血清抗體陽(yáng)性率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但在檢測(cè)T4感染小鼠血清時(shí),rATPA-ELISA的陽(yáng)性率低于ES-ELISA (P0.05)。 應(yīng)用rATPA-ELISA與ES-ELISA檢測(cè)旋毛形線蟲感染小鼠血清的抗體陽(yáng)性率分別為96.67%(29/30)和100%(30/30)(P0.05),檢測(cè)裂頭蚴感染小鼠血清的抗體陽(yáng)性率分別為16.13%(5/31)和3.22%(1/31)(P0.05),檢測(cè)日本血吸蟲感染小鼠血清的抗體陽(yáng)性率分別為68.75%(11/16)和6.25%(1/16)(P0.05)。rATPA-ELISA與ES-ELISA檢測(cè)弓形蟲感染小鼠血清及正常小鼠血清均為陰性。 4rATPA-ELISA檢測(cè)不同劑量旋毛蟲感染小鼠后不同時(shí)間的血清抗體水平 在重、中、輕度旋毛蟲感染小鼠,rATPA-ELISA首次檢測(cè)到旋毛蟲抗體的時(shí)間分別是感染后8、12及14天,ES-ELISA首次檢測(cè)到旋毛蟲抗體的時(shí)間分別是感染后10、8及10天。在旋毛蟲重度感染組,感染后12天和14天,rATPA-ELISA檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率分別為20%和40%,ES-ELISA檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率分別為80%和100%(P0.05)；在旋毛蟲中度感染組,感染后10、12和14天,rATPA-ELISA檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率分別為0、20%和30%,ES-ELISA檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率分別為70%、100%和100%(P0.05)；在旋毛蟲輕度感染組,感染后12～24天隔天(感染后12、14、16、18、20、22和24天),rATPA-ELISA檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率分別為0、10%、10%、10%、30%、30%和30%,ES-ELISA檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率分別為10%、60%、80%、80%、80%、100%和100%(P0.05)。在輕、中、重度旋毛蟲感染小鼠,rATPA-ELISA檢測(cè)到旋毛蟲抗體100%的時(shí)間分別是在感染后30、22及28天,ES-ELISA檢測(cè)到旋毛蟲抗體100%的時(shí)間分別為感染后22、12及14天。結(jié)果表明,在旋毛蟲重、中及輕度感染組,在感染后16、16及26天,rATPA-ELISA與ES-ELISA檢測(cè)的血清抗體陽(yáng)性率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 rATPA-ELISA檢測(cè)重、中、輕度感染小鼠血清抗體水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.049,P0.05),感染后不同時(shí)間的抗體水平之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=219.924,P0.05),感染后檢測(cè)時(shí)間與感染劑量之間存在交互關(guān)系(F=3.311,P0.05)；兩兩比較結(jié)果顯示,感染后10～16天及24～28天血清抗體水平均呈升高趨勢(shì)(P0.05)。ES-ELISA檢測(cè)重、中、輕度感染小鼠血清抗體水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.901,P0.05),感染后不同時(shí)間的抗體水平之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=478.276,P0.05),感染后檢測(cè)時(shí)間和感染劑量之間存在交互關(guān)系(F=5.710,P0.05)；兩兩比較結(jié)果顯示感染后8-32天血清抗體水平均呈升高趨勢(shì)(P0.05)。 5rATPA用于旋毛蟲病人血清抗體的檢測(cè) rATPA-ELISA和ES-ELISA檢測(cè)旋毛蟲病人血清抗體陽(yáng)性率均為100%(22/22), rATPA-ELISA僅在日本血吸蟲病人血清檢測(cè)到1例抗體陽(yáng)性(5.000%),而檢測(cè)并殖吸蟲病人、華支睪吸蟲病人、棘球蚴病人、豬囊尾蚴病人、裂頭蚴病人及健康人血清抗體均為陰性。rATPA-ELISA檢測(cè)旋毛蟲病人血清抗體的敏感性與特異性分別為100%與99.13%。ES-ELISA檢測(cè)日本血吸蟲病人、并殖吸蟲病人、華支睪吸蟲病人、棘球蚴病人、豬囊尾蚴病人、裂頭蚴病人抗體抗體陽(yáng)性率分別為20.00%(4/20)、5-00%(1/20)、14.29%(1/7)、25.00%(5/20)、25.00%(5/20)和12.50%(1/8),而檢測(cè)健康人血清抗體為陰性。rATPA-ELISA和ES-ELISA檢測(cè)日本血吸蟲病人、并殖吸蟲病人、華支睪吸蟲病人和裂頭蚴病人血清的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而在檢測(cè)棘球蚴病人和豬囊尾蚴病人血清時(shí),rATPA-ELISA優(yōu)于ES-ELISA (P0.05)。 結(jié)論 1.應(yīng)用2-DE與質(zhì)譜分析從旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白中鑒定出了7種旋毛蟲蛋白(2種絲氨酸蛋白酶、DNase Ⅱ、2種胰蛋白酶、保護(hù)性抗體靶向抗原及保守的假定蛋白),均具有催化和水解活性,這7種蛋白對(duì)旋毛蟲病可能具有潛在的早期診斷價(jià)值。 2.成功構(gòu)建了旋毛蟲ATPA基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X-ATPA, rATPA以可溶與包涵體2種形式表達(dá)。ATPA基因在旋毛蟲4個(gè)發(fā)育期(成蟲、新生幼蟲、成囊前期幼蟲和成囊期幼蟲)均有轉(zhuǎn)錄與表達(dá),主要定位于蟲體表皮與桿狀體。 3.rATPA-ELISA檢測(cè)旋毛蟲感染小鼠和旋毛蟲病人血清抗體具有良好的敏感性與特異性,提示rATPA具有用于旋毛蟲病的血清學(xué)診斷的潛能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R532.14

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1817494