本文選題：CAR-T細(xì)胞 + HIV-1潛伏感染�。� 參考：《中山大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究目的人類免疫缺陷病毒1型(Human Immunodificiency Viruse 1,HIV-1)感染后,聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(combined antiretroviral therapy,c ART)可以有效地抑制病毒復(fù)制。然而,由于病毒整合在被感染細(xì)胞中并形成一個(gè)穩(wěn)定的潛伏感染儲存庫,被感染者一旦停止c ART治療病毒血癥即在短時(shí)間內(nèi)再爆發(fā),這構(gòu)成了治愈HIV-1感染的主要障礙。當(dāng)前的研究熱點(diǎn)是通過特異性的潛伏感染逆轉(zhuǎn)藥物(latency-reversing agents,LRAs)激活潛伏感染的病毒,進(jìn)而藥物治療或誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)殺滅被感染細(xì)胞。這種干預(yù)策略被稱為“shock and kill”。然而,HIV-1可以迅速的發(fā)生突變以逃避免疫識別。研究顯示在經(jīng)過c ART治療的感染者當(dāng)中,即使成功激活了其潛伏感染,體內(nèi)的CD8+T淋巴細(xì)胞由于缺乏對HIV-1有效的免疫應(yīng)答,所以不能完全清除被感染的細(xì)胞。因此,在“shock and kill”策略中,為了更好的清除潛伏感染儲存庫,需要在被感染者體內(nèi)重建強(qiáng)有力的免疫監(jiān)控機(jī)能。近年來,由于具有高親和力、TCR(T cell receptor)非依賴和MHC(major histocompatibility complex)非限制等特點(diǎn),嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)的免疫細(xì)胞療法成為了殺傷腫瘤細(xì)胞的全新途徑。CAR是由抗體靶向區(qū)域與T細(xì)胞激活胞內(nèi)信號區(qū)融合而成,從而賦予細(xì)胞特異性抗原識別能力。通過在患者自體免疫細(xì)胞中表達(dá)識別腫瘤天然抗原的CAR分子并對進(jìn)行過繼免疫回輸,可以特異性的靶向殺傷患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞療法已在白血病和淋巴瘤的臨床治療中證明了有效性,并且獲得了令人鼓舞的成功。該策略也可應(yīng)用于抗病毒治療,包括HIV-1、HBV(hepatitis B virus)和HCV(hepatitis C virus)等病毒感染的治療。已有的研究通過將HIV-1特異性的單鏈抗體的可變區(qū)(single-chain variable fragment,sc Fv))或天然的CD4分子中的抗原識別/結(jié)合區(qū)域連接到CD8+T淋巴細(xì)胞受體的胞內(nèi)T細(xì)胞激活區(qū)域產(chǎn)生了HIV-1特異性的CAR-T細(xì)胞,該細(xì)胞可以殺傷表達(dá)HIV-1包膜蛋白的細(xì)胞。然而,該方法是否能夠清除經(jīng)過c ART治療的HIV-1感染者的潛伏感染儲存庫還不得而知。研究方法在本文中,通過分子克隆將HIV-1廣譜中和抗體VRC01來源的sc Fv序列和三種不同的CAR分子胞內(nèi)段序列連接在一起,分別作為胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu),隨后分別轉(zhuǎn)導(dǎo)至原代CD8+T淋巴細(xì)胞中。我們通過對細(xì)胞毒性檢測篩選得到最有效的CAR模塊(VC-CAR)并且比較了VC-CAR和已報(bào)道的CD4-CAR的功能。然后,通過將VC-CAR-T細(xì)胞與兩株表達(dá)HIV-1包膜蛋白的細(xì)胞系或野生型HIV-1感染的CD4+T淋巴細(xì)胞分別進(jìn)行共培養(yǎng),檢測其細(xì)胞因子分泌和特異性的細(xì)胞殺傷功能。利用體外感染模型模擬撤除抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的體內(nèi)病毒血癥反彈過程,檢測VC-CAR-T細(xì)胞的抑制病毒血癥反彈的作用。最后,我們在VC-CAR-T細(xì)胞存在的條件下進(jìn)行了病毒增殖實(shí)驗(yàn)(Viral outgrowth assay,VOA),以確定VC-CAR-T細(xì)胞是否可以在經(jīng)過c ART治療的感染者樣本中清除HIV-1潛伏感染。研究結(jié)果本研究中全新改造的VC-CAR-T細(xì)胞與表達(dá)gp120的細(xì)胞系或HIV-1感染的CD4+T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),VC-CAR-T細(xì)胞可以被特異性激活并大量分泌細(xì)胞毒性相關(guān)的細(xì)胞因子(包括IFN-γ、IL-2和Granzyme B),進(jìn)而強(qiáng)有力地介導(dǎo)表達(dá)gp120的細(xì)胞系或HIV-1感染的CD4+T淋巴細(xì)胞的裂解。并且相比已報(bào)道的CD4-CAR-T細(xì)胞,VC-CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)表達(dá)gp120細(xì)胞系的裂解效果更加明顯。體外HIV-1感染CD4+T淋巴細(xì)胞的模型中,通過抗病毒的藥物組合(逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑)的施加和撤除,模擬了臨床實(shí)踐中c ART終止的情況,并且證明了抗病毒的化合物撤除后,VC-CAR-T細(xì)胞可以顯著抑制HIV-1的反彈。更重要的是,在經(jīng)過c ART治療的HIV-1感染者樣本當(dāng)中,在利用多種LRA組合重新激活其HIV-1潛伏感染儲存庫后,VC-CAR-T細(xì)胞能夠強(qiáng)有力地持續(xù)抑制HIV-1的復(fù)制和產(chǎn)生,有效清除重新激活的HIV-1潛伏感染的CD4+T淋巴細(xì)胞。研究結(jié)論我們的結(jié)果表明,在功能性治愈HIV-1感染的實(shí)驗(yàn)探索和臨床實(shí)踐過程當(dāng)中,由于VC-CAR-T細(xì)胞諸多特點(diǎn)和優(yōu)勢,可以清除c ART治療HIV-1感染者樣本中被激活的潛伏感染儲存庫,VC-CAR-T細(xì)胞療法是一條適合的候選途徑,值得進(jìn)一步的理論研究和技術(shù)優(yōu)化。
[Abstract]:Human immunodeficiency virus type 1 ( HIV - 1 ) has been infected by human immunodeficiency virus type 1 ( HIV - 1 ) . Since the virus is integrated into infected cells and forms a stable latent infection repository , it is a new way to cure HIV - 1 infection . HBV(hepatitis B virus)鍜孒CV(hepatitis C virus)絳夌梾姣掓劅鏌撶殑娌葷枟.宸叉湁鐨勭爺絀墮，

本文編號：1812859