本文選題：HIV-1 + 相互作用��； 參考：《吉林大學》2013年博士論文

【摘要】：Vif（viral infectivity factor）基因編碼的蛋白作為HIV-1（AIDS病原體）的六個輔助因子之一，是一個高堿性的分子量為23kDa的磷蛋白，它在逆轉(zhuǎn)錄病毒生命周期的早期步驟和晚期步驟中發(fā)揮功能。HIV-1對Vif的需求受產(chǎn)病毒細胞的類型限制，即Vif對于HIV-1在非允許型細胞系中產(chǎn)生有傳染效力的子代病毒和有效感染其他細胞至關重要，缺失了Vif的HIV-1能在允許細胞中而不能在非允許細胞有效復制。而特異性表達于非允許細胞中的APOBEC3G（CEM15）提供了這個非允許特性。它在2002年被鑒定為抗HIV-1的宿主因子。它主要作用于病毒生命周期的早期，能夠包裝進入多種逆轉(zhuǎn)錄病毒（HIV-1/HIV-2，馬傳染性貧血病毒，多種猴免疫缺陷病毒等等），隨即啟動大規(guī)模的針對逆病毒新生負義鏈cDNA的脫氨基作用，，借此引發(fā)病毒基因組的高突變，導致病毒蛋白發(fā)生錯義突變或提前終止病毒蛋白轉(zhuǎn)錄。 Vif能夠?qū)3G的抗病毒作用進行中和，它通過將APOBEC3G募集到人體內(nèi)的CBF-β-ElonginB-ElonginC-Cullin5-Rbx（CBF-b-EloB-EloC-Cul5-Rbx）復合物上形成E3泛素連接酶上介導其降解。Vif用于募集E3復合物的功能位點已經(jīng)被研究得比較透徹，Vif的N端包含了與CBF-β和A3G相互作用的位點，Vif的C端包含一個用于結合EloB-EloC的SOCS-box基序，一個用于結合Cul5的HCCH鋅指基序。E3復合物中的每個組分對于降解A3G都不可或缺。Vif在復合物中作為A3G底物的接頭分子，新發(fā)現(xiàn)的CBF-β通過調(diào)節(jié)Vif折疊作為調(diào)節(jié)子，EloB-EloC也是調(diào)節(jié)亞基而Cul5為基架蛋白。盡管關于Vif各區(qū)域功能的報道與日俱增，Vif結構仍未能得到徹底解析，2008年Vif SOCS基序的結構得到解析然而更多的Vif結構信息仍有待探索。作為新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)亞基，CBF-β乃至整個E3的功能機制仍有待完善。 本論文針對Vif-EloB-EloC復合物結構以及該復合物各組分間的相互作用機制展開了研究。我們對該復合物的組成蛋白進行多種截短和組合，通過X-蛋白晶體衍射技術試圖進一步解析Vif結構及其與EloB-EloC的相互作用界面。以期獲得最直接的作用機制信息指導治療藥物設計。通過蛋白共折疊可溶性分析，RNA沉默，免疫共沉淀，體內(nèi)穩(wěn)定性，關鍵基序突變等多種分子生物學手段分析E3復合物各組分相互作用機制。 在蛋白復合物結構研究部分，應用改良載體PMR1以及具有多個讀碼框，能夠同時表達多種蛋白的原核表達載體pST39作為復合物表達載體，我們構建，表達并純化了HIV-1Vif蛋白單體及其六種復合物：PMR1-Vif；pST-EloC-EloB-vif；pST-EloC-EloB-Vif-Cul511-191； pST-EloC-EloB-Vif-Cul51-159；pST-EC-EB-Vif-Cul51-230； pST-EloCΔN17-EloB-VifΔN97； pST-EloCΔN17-EloBΔC20-VifΔN97。均獲得可供晶體生長的可溶蛋白，其中Vif單體，EloCΔN17-EloB-VifΔN97，EloCΔN17-EloBΔC20-VifΔN97獲得了純度在95%以上的寡聚蛋白，Vif單體蛋白獲得衍射為1.6的晶體，然而由于缺乏結構模型，硒代衍生物結晶失敗而無法解析。隨后我們對純化得到的EloCΔN17-EloB-VifΔN97蛋白復合物進行了溫和的胰蛋白酶剪切處理，去掉折疊松散，肽鏈骨架靈活度過高的區(qū)段，使得該復合物結晶概率提高。得到分辨率2.4可供結構解析的晶體，然而由于該晶體為孿晶難以成功解析，現(xiàn)正對已獲得的結晶條件進行結晶溫度優(yōu)化，沉淀劑濃度優(yōu)化，PH值優(yōu)化等一系列優(yōu)化，以期提高晶體質(zhì)量，得到成功解析。 對酶切處理前后的復合物VifΔN97-EB-ECΔN17進行免疫印跡法分析，發(fā)現(xiàn)酶切后EloB，EloC分子量沒有明顯改變，而Vif的分子量顯著減小到4-5kDa，通過液相串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析認為酶切后Vif片段約為殘基123-168，說明該區(qū)段折疊緊實因而防止了胰蛋白酶的剪切，揭示了Vif與EloB-EloC共折疊時C端的折疊核心。而對酶切前后復合物進行濁度分析等物理化學性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)酶切后的復合物性質(zhì)與酶切前有所不同，酶切后的蛋白熱穩(wěn)定性更優(yōu)于酶切前。通過該部分研究，我們對從一個新的角度分析了Vif C端的折疊。 在復合物功能分析部分，為了深入研究Vif-EloB-EloC-CBF-β復合物成員的功能與組裝，我們沉默了內(nèi)源EloB的表達，發(fā)現(xiàn)以下結論：（1）和以前一些研究結果相同，沉默了內(nèi)源的EloB后，EloC的內(nèi)源表達量將隨之下降，再次肯定了EloB和EloC是作為專性復合物存在的。（2）EloB表達下調(diào)后，影響了Vif對A3G的降解，使得Vif阻止A3G包裝進病毒的功能下降，從而使Vif拮抗A3G抗病毒的能力下降。（3）研究這一現(xiàn)象的機理，我們發(fā)現(xiàn)EloB表達下調(diào)后，會顯著削弱CBF-β, Cul5與Vif的結合而不影響A3G與Vif的結合。（4）我們使用了VifΔSLQ這一能夠削弱EloB-EloC結合的Vif突變體，發(fā)現(xiàn)其結合CBF-β的能力顯著弱于野生型Vif。（5）我們構建了刪除Vif結合位點的EloBΔC34突變體，發(fā)現(xiàn)該突變體的過表達能夠削弱Vif對A3G的降解能力且該削弱為劑量依賴性的，也能夠削弱Vif對A3G抗病毒功能的拮抗。（6）使用刪除了EB作用位點的VifΔPPL突變體，發(fā)現(xiàn)該突變能夠削弱CBF-β與Vif的作用。（7）在大腸桿菌內(nèi)通過共表達可溶性驗證發(fā)現(xiàn)，只有EloB-EloC存在的情況下，才能夠通過輔助Vif折疊使得Vif與CBF-β大量存在于上清中。我們由以上發(fā)現(xiàn)得到結論：Vif與EloB-EloC的相互作用對于Vif與CBF-β的相互作用十分重要。此外我們還發(fā)現(xiàn)EloB及其泛素樣結構域的過表達能夠顯著穩(wěn)定Vif在細胞內(nèi)的蛋白水平，該發(fā)現(xiàn)豐富了泛素樣分子的功能多樣性。 本研究為解析Vif-EloB-EloC復合物相互作用的結構界面提供了基礎，延伸了我們對Vif-Cul5E3復合物功能機制的理解，為HIV的藥物治療提供了新的可能性。
[Abstract]:The protein encoded by the Vif (viral infectivity factor) gene is one of the six cofactors of the HIV-1 (AIDS pathogen), and is a highly alkaline phosphor with a molecular weight of 23kDa. It plays the function of.HIV-1 to Vif in the early steps of the retroviral life cycle and in the late steps, which is limited by the type of virus producing cells, that is, Vif pairs. HIV-1 is essential for the generation of infective offspring viruses in non permissible cells and the effective infection of other cells, and the missing Vif HIV-1 can not be effectively replicated in non permissible cells in permissible cells. APOBEC3G (CEM15) specifically expressed in non permissible cells provides this non permissible characteristic. In 2002, it was identified. It is defined as the host factor of anti HIV-1. It mainly acts on the early stage of the virus's life cycle, and can be packed into a variety of retroviruses (HIV-1/HIV-2, equine infectious anemia virus, multiple monkey immunodeficiency virus, etc.), and then initiates a large-scale deamination of cDNA for the negative sense chain of the reverse virus, thus triggering the high genome of the virus. Mutation leads to missense mutation or premature termination of viral protein transcription.
Vif can neutralize the antiviral effect of A3G, which has been well studied through the formation of a E3 ubiquitin ligase on the CBF- beta (CBF-b-EloB-EloC-Cul5-Rbx) complex of the human body to form a E3 ubiquitin ligase on the CBF- beta -ElonginB-ElonginC-Cullin5-Rbx (CBF-b-EloB-EloC-Cul5-Rbx) complex in the human body. The N end of the Vif is included with CB. The site of the interaction of F- beta and A3G, the C end of Vif contains a SOCS-box motif for the combination of EloB-EloC, and a HCCH zinc finger based.E3 complex for Cul5, which is indispensable for the degradation of A3G, which is indispensable for.Vif in the complex as a A3G substrate. EloB-EloC also regulates subunits and Cul5 as the base protein. Although reports on the functions of Vif are increasing, the structure of Vif has not been thoroughly resolved. In 2008, the structure of the Vif SOCS motif is resolved, but more Vif structure information remains to be explored. As a newly discovered subunit, the functional mechanism of CBF- beta and even the whole E3 is still available. Be perfect.
In this paper, the structure of Vif-EloB-EloC complex and the interaction mechanism between the components of the complex are studied. We make a variety of truncation and combination of the composition of the complex. Through the X- crystal diffraction technique, we try to further analyze the Vif structure and the interaction interface with EloB-EloC. The interaction mechanism of E3 complex was analyzed by a variety of molecular biological means, such as protein co folding soluble analysis, RNA silencing, immunoprecipitation, stability in the body, key sequence mutation and other molecular biological means.
In the protein complex structure research part, we constructed, expressed and purified the HIV-1Vif protein monomer and its six complexes, PMR1-Vif; pST-EloC-EloB-vif; pST-EloC-EloB-Vif-Cul5, with the modified carrier PMR1 and a number of reading frame, which can express a variety of proteins at the same time as a complex expression vector. 11-191; pST-EloC-EloB-Vif-Cul51-159; pST-EC-EB-Vif-Cul51-230; pST-EloC Delta N17-EloB-Vif Delta N97; pST-EloC Delta N17-EloB Delta C20-Vif Delta N97. all obtained soluble protein for crystal growth, including Vif monomer, EloC Delta N17-EloB-Vif Delta. White obtained a crystal of 1.6 diffraction, however, due to the lack of structural models, the crystallization of the selenide derivatives failed to be resolved. Then we treated the purified EloC Delta N17-EloB-Vif Delta N97 protein complex by mild trypsin treatment to remove the areas of folded looseness and high activity of the peptide chain framework, making the complex crystallization almost. The resolution 2.4 can be obtained for the crystal of structure resolution. However, because the crystal is difficult to analyze the twins, the crystallization temperature is optimized, the concentration of precipitant is optimized, the pH value is optimized, so as to improve the crystal quality and obtain the successful analysis.
The Vif Delta N97-EB-EC Delta N17 before and after the enzyme digestion was analyzed by immunoblotting, and the molecular weight of EloC was not significantly changed after the enzyme was cut, and the molecular weight of Vif decreased to 4-5kDa significantly, and the Vif fragment of the enzyme was about 123-168 after the digestion of the enzyme by the liquid phase tandem mass spectrometry. It showed that the section was tightly folded and thus prevented the pancreas and thus prevented the pancreas. The shear of protease reveals the folding core of the C end when Vif and EloB-EloC are folded. And the physicochemical properties of the turbidimetric analysis of the complex before and after the enzyme digestion show that the properties of the compound after the enzyme are different from that before the enzyme, and the thermostability of the protein after the enzyme is better than that before the enzyme. The angle of the Vif C end is analyzed.
In the complex function analysis part, in order to study the function and assembly of Vif-EloB-EloC-CBF- beta complex members, we silence the expression of endogenous EloB, and find the following conclusion: (1) after the same research results, after the silence of the endogenous EloB, the endogenous expression of EloC will decrease, and EloB and EloC are reaffirmed as special. The existence of sexual complex. (2) the downregulation of EloB affects the degradation of Vif to A3G, which prevents the Vif from decreasing the function of A3G packaging into the virus, thus reducing the ability of Vif to antagonize the antiviral ability of A3G. (3) the mechanism of this phenomenon is studied. We found that the downregulation of EloB expression will significantly weaken the combination of CBF- beta, Cul5 and Vif without affecting A3G and Combined. (4) we used Vif Delta SLQ, a Vif mutant that could weaken EloB-EloC binding, and found that its ability to bind CBF- beta was significantly weaker than that of wild type Vif. (5). We constructed a EloB Delta C34 mutant that deleted the Vif binding site, and found that the overexpression of the mutant could weaken the degradability of Vif to A3G and should be reduced to a dose-dependent manner. It can also weaken the antagonism of Vif to A3G anti-virus function. (6) using the Vif Delta PPL mutant that deletes the EB action site, it is found that the mutation can weaken the effect of CBF- beta and Vif. (7) in Escherichia coli, by co expression of soluble validation, it is found that only EloB-EloC exists in the presence of auxiliary Vif folding to make Vif and CBF- beta large. It is found in the supernatant. We have found that the interaction between Vif and EloB-EloC is very important for the interaction between Vif and CBF- beta. In addition, we also found that the overexpression of EloB and its ubiquitin like domain can significantly stabilize the protein level of Vif in the cell, and the discovery that the functional diversity of ubiquitin like molecules is rich.
This study provides a basis for the analysis of the structural interface of Vif-EloB-EloC complex interactions, and extends our understanding of the functional mechanisms of Vif-Cul5E3 complexes, providing new possibilities for the drug treatment of HIV.

【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.91

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本文編號：1791858