發(fā)布時間：2018-04-23 00:17

  本文選題：miRNA + 登革病毒��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：背景：登革熱是全球蔓延最快的蟲媒傳染病之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2009年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,在過去50年,登革熱的發(fā)病率增加了30倍。與此同時,其流行區(qū)域仍在不斷擴(kuò)大：截止目前,已波及全球100余個國家和地區(qū)。其中,主要的流行區(qū)集中于非洲、南美洲、東南亞和西太平洋地區(qū)。近10年,登革熱的流行區(qū)域還從城市擴(kuò)大到了廣大農(nóng)村。據(jù)估計(jì),全世界每年約有5000萬人感染登革熱,2.5億人面臨登革感染的威脅。隨著全球氣候變暖、國際貿(mào)易和交流的增加、蟲媒分布區(qū)域的擴(kuò)大,城市化和人口增長迅速等因素多重影響下,登革的流行范圍和頻率還有不斷加劇的趨勢。在中國,自20世紀(jì)90年代以來,除海南、福建、浙江和江蘇省有登革熱爆發(fā)外,我國的登革熱主要在廣東省流行。 登革熱的病原體是登革病毒。登革病毒(dengue virus, DENV)是最重要的蟲媒病毒之一,在分類學(xué)上屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)家族成員。登革病毒的基因組為單股正義RNA,全長～11kb,含單一開放讀碼框(open reading frame, ORF),編碼一個～3400個氨基酸殘基的多聚蛋白前體。此多聚蛋白前體在翻譯或翻譯后水平被進(jìn)一步加工生成成熟的登革病毒的3個結(jié)構(gòu)蛋白(capsid, C, membrane, M, envelope, E)與7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1.NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5).登革病毒基因組5’和3’端分別為序列高度保守的5’非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)和3’非編碼區(qū)。登革病毒按照其抗原性分為5個血清型：DENV1～DEN-5。同個血清型下可分為不同的基因亞型。 登革病毒主要經(jīng)埃及伊蚊(Aedes aegypti, A. aegypti)和白紋伊蚊傳播(Aedes albopictus, A. albopictus)。在中國大陸,白紋伊蚊是主要的傳播媒介,對登革1～4型病毒均具有高度易感性。分布于我國熱帶及亞熱帶地區(qū),特別是南方沿海各省。媒介蚊蟲在攝取病毒血癥期的病人血液后,在叮咬其他人完成病毒傳播之前,在蚊體內(nèi),需經(jīng)一個過大約7-14天的外潛伏期(extrinsic incubation period,EIP)。在外潛伏期期間,含有登革病毒顆粒的血餐沉積在中腸消化,病毒首先感染中腸上皮細(xì)胞。登革病毒克服中腸感染屏障(midgut infection barrier, MIB)后,在中腸進(jìn)行復(fù)制,并釋放入蚊蟲血淋巴腔,然后穿越中腸逃逸屏障(midgut escape barriers, MEB)最終侵染唾液腺。一旦病毒到達(dá)唾液腺,蚊蟲便具有感染性。此時,具有感染性的蚊蟲可叮咬健康人類而使人感染登革病毒。人類對登革病毒普遍易感。人感染登革病毒后,根據(jù)臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度,臨床上分為登革熱(dengue fever, DF)、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever, DHF)、登革休克綜合征(the dengue shock syndrome, DSS)。其中,登革出血熱及登革休克綜合征病情兇險,病死率相對較高。 盡管登革熱的流行與傳播已成為全球公共衛(wèi)生面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn),造成各國的疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。但是迄今為止,臨床上尚無特異性的抗登革病毒治療藥物,亦無批準(zhǔn)上市使用的登革疫苗。目前而言,蚊媒防控仍然是重要的手段。因此,深入研究媒介蚊蟲與登革病毒相互之間的調(diào)控關(guān)系顯得尤為重要。 microRNA (miRNA)是近年來生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。miRNAs是一類廣泛存在于動物、植物、細(xì)菌、病毒等多種生物物種,長度為18-25nt的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA,其最早發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲中。目前,根據(jù)miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase最新版本Virsion20.0收錄數(shù)據(jù)顯示：已收錄206個物種的30424條成熟miRNA序列。 miRNA經(jīng)典的形成途徑如下：動物的絕大部分miRNA在細(xì)胞核內(nèi)首先主要由RNA聚合酶Ⅱ (RNA polymerase Ⅱ, Pol Ⅱ)轉(zhuǎn)錄生成長度約為80nt的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：初級miRNA (primary miRNA, pri-miRNA)。然后pri-miRNA在Pasha/DGR8的協(xié)同下,由核酸酶Drosha切割為3’端突出的,長度～60nt,具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA(precursor-miRNA,pre-miRN A)。pre-miRN A經(jīng)Exportin-5等分子將其轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核后進(jìn)入在細(xì)胞質(zhì)中,由Dicer將其加工成為22nt左右的miRNA和miRNA*雙鏈復(fù)合體。最終雙鏈復(fù)合體中的一條鏈成為成熟的miRNA,與包含有Argonaute family (Ago)蛋白家族的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)相結(jié)合。miRNA引導(dǎo)RISC結(jié)合至靶mRNA后在胞漿中積聚于P小體(P body)內(nèi),miRNA可能在P小體中行使其基因沉默功能。經(jīng)典的理論認(rèn)為,miRNA利用其5’端2-7個堿基的序列,被稱之為“種子”序列(seed sequence)區(qū)域識別靶基因mRNA3'-UTR的互補(bǔ)序列,引起靶基因：mRNA的降解或者翻譯抑制,從而實(shí)現(xiàn)其基因調(diào)控功能。 miRNA的基因調(diào)控功能覆蓋細(xì)胞內(nèi)的生長、分化、應(yīng)激、凋亡、腫瘤發(fā)生以及免疫活化等諸多重要的生命過程。除此之外,近年來的研究提示miRNA在病毒與宿主之間相互作用關(guān)系中,也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。一方面病毒可通過利用自身編碼的miRNA促進(jìn)病毒自身復(fù)制并抑制宿主細(xì)胞抗病毒活性以建立長期隱形感染；另一方面,宿主細(xì)胞亦編碼大量miRNAs,在調(diào)控自身基因表達(dá)的同時,亦可調(diào)控入侵病毒的復(fù)制。此外,宿主miRNA也可能被病毒所利用以促進(jìn)其維持潛伏或增進(jìn)復(fù)制。最具代表性的便是肝細(xì)胞特異性豐富表達(dá)的miR-122,其可通過與HCV基因組5'-UTR區(qū)的兩個互補(bǔ)序列相互作用,增強(qiáng)HCV在肝細(xì)胞中的復(fù)制,被認(rèn)為HCV肝臟嗜性的重要因子之一。 媒介蚊蟲miRNA研究也取得了相當(dāng)進(jìn)展。研究者利用高通量測序結(jié)合NorthernBlot等實(shí)驗(yàn)方法,在瘧疾媒介岡比亞按蚊、斯氏按蚊,西尼羅河病毒媒介致倦庫蚊以及登革病毒媒介蚊蟲埃及伊蚊、白紋伊蚊的研究中,鑒定出了大量miRNAs。其中,本課題組吳錦雅博士、鄭培明碩士運(yùn)用solex測序和Northern Blot的方法首次鑒定了白紋伊蚊miRNAs。 然而,盡管蚊蟲的小RNA研究獲得了大量miRNA數(shù)據(jù),但是基于這些數(shù)據(jù)的功能分析,特別是有關(guān)蚊miRNA與登革病毒相互調(diào)節(jié)關(guān)系的認(rèn)識卻知之甚少�；诖�,本研究利用本課題組前期吳錦雅博士和鄭培明碩士所獲得的白紋伊蚊miRNA序列及雌蚊感染登革病毒前后miRNA表達(dá)水平的數(shù)據(jù),進(jìn)一步探討白紋伊蚊miRNA在調(diào)控登革病毒復(fù)制方面的潛在功能。 目的：本研究基于已獲得的白紋伊蚊miRNA測序數(shù)據(jù),進(jìn)一步探討白紋伊蚊在miRNA水平對登革病毒的調(diào)控作用。蚊中腸作為蚊媒病原傳播的重要器官,對登革病毒的感染與傳播有著非常重要的作用。在本研究中,我們重點(diǎn)關(guān)注中腸組織特異性表達(dá)的miRNA。首先,構(gòu)建白紋伊蚊及其C6/36細(xì)胞系的登革病毒感染模型。其次,利用人工合成miRNA的模擬物miRNA mimic及miRNA反義抑制劑miRNA antagomiR過表達(dá)或者抑制靶miRNA來初步探討白紋伊蚊中腸組織特異性表達(dá)miRNA對于登革病毒復(fù)制的調(diào)控作用。由于目前臨床上針對登革病毒尚無特效的抗病毒藥物亦無批準(zhǔn)上市的疫苗,因此本研究將為登革病毒的蚊媒防控提供的新思路。 方法： 1.建立登革Ⅱ型病毒NGC株(DENV-2)感染模型。使用C6/36細(xì)胞培養(yǎng)方法繁殖DENV-2,建立白紋伊蚊C6/36細(xì)胞系的DENV-2感染模型。使用口飼感染方法,建立白紋伊蚊體內(nèi)DENV-2感染模型。 2. miR-281表達(dá)譜分析。使用實(shí)時定量PCR (real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)結(jié)合Northern Blot方法,首先驗(yàn)證基礎(chǔ)高拷貝miR-281在白紋伊蚊頭、胸、中腸及剩余組織的表達(dá)水平。其次,使用RT-qPCR和Norterh Blot方法還分別檢測DENV-2感染1天,4天,7天后miR-281在白紋伊蚊雌蚊、白紋伊蚊中腸組織的表達(dá)水平；此外,還使用RT-qPCR方法分別檢測DENV-2感染C6/36細(xì)胞24h,48h,72h,96h后miR-281的表達(dá)水平。 3. miR-281細(xì)胞水平調(diào)控DENV-2復(fù)制功能分析。首先使用人工合成miR-281模擬物(miR-281mimic)及相對應(yīng)的miR-281抑制劑(antagomiR-281)過表達(dá)或者抑制C6/36細(xì)胞內(nèi)miR-281表達(dá)水平。將miR-281mimic轉(zhuǎn)染C6/36細(xì)胞,同時設(shè)立無轉(zhuǎn)染處理的對照組mock組、轉(zhuǎn)染control mimic的對照組controlmimic組；相對應(yīng),抑制劑轉(zhuǎn)染組antagomiR-281組設(shè)立無轉(zhuǎn)染處理mock組及轉(zhuǎn)染control antagomiR的陰性對照組control antagomiR組。轉(zhuǎn)染后48h,使用RT-qPCR檢測細(xì)胞內(nèi)miR-281的過表達(dá)或者抑制效果。細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后24h接種DENV-2病毒(MOI=0.1),接種后48h分別提取各組細(xì)胞總RNA及總蛋白。總RNA用RT-qPCR方法檢測各組DENV-2的基因組RNA(genomic RNA, gRNA)合成水平,總蛋白用Western Blot方法檢測各組DENV-2的E protein合成水平。此外,antagomiR-281組及其相應(yīng)mock, control antagomiR對照組細(xì)胞上清中DENV-2的滴度使用TCIDso法測定。 4. miR-281體內(nèi)水平調(diào)控DENV-2復(fù)制功能分析。使用胸腔注射方法,將antagomiR-281及對照control antagomiR分別注射入雌蚊體內(nèi),同時設(shè)立mock對照組,即未經(jīng)注射處理的正常白紋伊蚊雌蚊。胸腔注射后48h,各組蚊子經(jīng)口飼感染DENV-2,感染后第4天,分別提取各組蚊子總RNA并用RT-qPCR檢測各組蚊子的DENV-2gRNA合成水平。 5. miR-281靶基因預(yù)測。首先使用RNAhybrid軟件預(yù)測niR-281在DENV-2基因組上的潛在靶位點(diǎn)。此外,提取感染DENV-2后48h C6/36細(xì)胞總RNA送公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。使用RNAhybrid與miRanda軟件預(yù)測miR-281在白紋伊蚊C6/36細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中的潛在靶基因。 6. miR-281靶基因驗(yàn)證。構(gòu)建EGFP報(bào)告基因的載體驗(yàn)證miR-281在DENV-2基因組上的潛在靶位點(diǎn)。以pIB/V5-His表達(dá)載體為基礎(chǔ),將EGFP克隆入pIB/V5-His,構(gòu)建成pIB/EGFP報(bào)告載體。以pIB/EGFP報(bào)告載體為基礎(chǔ),進(jìn)一步將預(yù)測靶序列克隆入報(bào)告載體相應(yīng)位置構(gòu)建成為靶標(biāo)載體,同時突變靶序列中與miR-281種子序列結(jié)合位點(diǎn)的堿基,采取與靶標(biāo)載體一樣的克隆策略構(gòu)建成靶標(biāo)突變載體。將這兩個載體分別與miR-281mimic共轉(zhuǎn)染入C6/36細(xì)胞,設(shè)立靶標(biāo)載體與control mimic共轉(zhuǎn)染的對照,轉(zhuǎn)染后48h使用RT-qPCR分別檢測各組細(xì)胞中報(bào)告基因EGFP的表達(dá)水平。為驗(yàn)證miR-281在白紋伊蚊C6/36細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中的潛在靶基因,細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-281mimic, control mimic,同時設(shè)未經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞組mock對照組,轉(zhuǎn)染48h后,分別提取各組總RNA,RT-qPCR分別檢測各組EGFP表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.在本實(shí)驗(yàn)室成功地建立了白紋伊蚊及白紋伊蚊C6/36細(xì)胞DENV-2感染模型,獲得了大量高滴度的DENV-2儲存液。 2.利用qPCR檢測方法獲得了miR-281的組織表達(dá)譜及DENV-2感染后miR-281的表達(dá)水平。首先,檢測白紋伊蚊雌蚊miR-281在頭、胸、中腸及剩余部位的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)miR-281在中腸組織顯著特異性高表達(dá)(Welch=276.775,P0.001)。其次,檢測白紋伊蚊雌蚊經(jīng)口感染DENV-2后第1天miR-281表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)miR-281在白紋伊蚊雌蚊及其中腸組織中,其表達(dá)水平無顯著差異(all P0.05),而在感染后的第4天及第7天,表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著上調(diào)(allP0.001)。此外,在白紋伊蚊C6/36細(xì)胞系中,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞感染DENV-296h后表達(dá)量顯著增高(F=-15.245,P0.001),而在感染后的24,48和72h則無顯著性的變化(all P0.05)。此外,我們還使用Northern Blot對表達(dá)譜進(jìn)行了驗(yàn)證,其結(jié)果與qPCR檢測結(jié)果一致。 3.使用人工合成miR-281mimic或antagomiR可以顯著過表達(dá)(F=136.926,P0.001)或者抑制(F=931.631, P0.001) C6/36細(xì)胞miR-281的表達(dá)水平。過表達(dá)或者抑制細(xì)胞中miR-281后,各組分別感染DENV-2,然后分別從mRNA水平,蛋白水平,以及病毒活力分別檢測過表達(dá)/抑制組與相應(yīng)對照組病毒復(fù)制水平的差異,發(fā)現(xiàn)miR-281表達(dá)水平增高,DENV-2gRNA和E蛋白在細(xì)胞內(nèi)的合成水平顯著增強(qiáng)(a11P0.001)；相反,miR-281表達(dá)水平下調(diào),DENV-2gRNA與E蛋白的合成水平顯著下降(all P0.001), DENV-2病毒滴度也顯著下降(P0.01)。 4.白紋伊蚊雌蚊經(jīng)胸腔注射antagomiR-281可以顯著抑制內(nèi)源性miR-281在蚊體內(nèi)的整體水平(F=401.245,P0.001)及中腸組織中miR-281的表達(dá)水平(F=84.625,P0.001)。抑制雌蚊體內(nèi)miR-281表達(dá)水平后,各組口飼感染DENV-2,感染后第4天檢測病毒在體內(nèi)的gRNA合成水平發(fā)現(xiàn)：antagomiR-281注射組即抑制組,其DENV-2gRNA的合成水平顯著低于其他對照組(F=103.613,P0.001)。 5.miR-281靶基因生物信息學(xué)分析預(yù)測。使用RNAhybrid軟件,基于自由能(mfe)的分?jǐn)?shù),預(yù)測到miR-281的一個潛在靶結(jié)合位點(diǎn)。預(yù)測結(jié)果顯示該靶點(diǎn)位于5’-UTR的一個保守的SLA結(jié)構(gòu),mfe=-21.4kcal/mol。使用RNAhybrid與miRanda軟件同時預(yù)測miR-281在白紋伊蚊C6/36細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中的潛在靶基因。測序結(jié)果顯示：使用RNAhybrid靶基因預(yù)測軟件分析預(yù)測到35條靶標(biāo)序列；使用miRanda預(yù)測軟件分析預(yù)測到87條潛在靶基因序列。其中,二者靶序列的交集序列共11條。 6.miR-281針對DENV-2靶位點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。以pIB/EGFP報(bào)告載體為基礎(chǔ),將DENV-25'-UTR靶序列克隆入報(bào)告載體EGFP上游,構(gòu)建成靶標(biāo)載體(pIB/5-UTR-EGFP)；突變靶序列中與miR-281種子序列結(jié)合位點(diǎn)的堿基并克隆入報(bào)告載體EGFP上游,構(gòu)建成為突變載體(pIB/5UTR-EGFP)。利用EGFP報(bào)告基因檢測系統(tǒng)研究miR-281和DENV-25'-UTR靶標(biāo)序列間的相互作用：將這兩個載體分別與miR-281mimic共轉(zhuǎn)染入C6/36細(xì)胞,設(shè)立靶標(biāo)載體與control mimic共轉(zhuǎn)染的對照。qPCR結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染control mimic相比,miR-281mimic顯著增強(qiáng)含5’-UTR靶標(biāo)序列的靶標(biāo)載體的熒光強(qiáng)度。然而,對靶標(biāo)序列進(jìn)行突變后, miR-281mimic則不能增強(qiáng)含突變靶序列的報(bào)告載體的熒光強(qiáng)度(F=40.111,P0.001),提示miR-281和位于DENV-2NGC株靶標(biāo)序列間在EGFP報(bào)告載體系統(tǒng)中存在相互作用。 7.miR-281針對白紋伊蚊C6/36細(xì)胞靶基因驗(yàn)證。測序獲得了白紋伊蚊C6/36細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄組初步數(shù)據(jù),使用靶基因預(yù)測軟件RNAhybrid與miRanda預(yù)測miR-281針對白紋伊蚊C6/36細(xì)胞靶基因獲得11條交集潛在靶序列。從11條交集序列中進(jìn)一步選擇擁有注釋的4條序列進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示：使用RT-qPCR檢測過表達(dá)miR-281的C6/36細(xì)胞中4條序列的表達(dá)水平分別與對照組相比(mock和control mimic),均無顯著性差異,提示他們不存在相互作用關(guān)系。 結(jié)論：我們發(fā)現(xiàn)白紋伊蚊中腸特異性表達(dá)的miR-281在感染DENV-2后呈現(xiàn)表達(dá)水平上調(diào)。使用人工合成miRNA mimic及其反義抑制物miRNA antagomiR過表達(dá)或者抑制細(xì)胞及成蚊miR-281表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),miR-281正向調(diào)控DENV-2在細(xì)胞水平及其白紋伊蚊體內(nèi)的復(fù)制。為進(jìn)一步探討miR-281與DENV-2復(fù)制的初步作用機(jī)制,使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析miR-281在DENV-2基因組的潛在結(jié)合位點(diǎn)并利用EGFP報(bào)告基因載體發(fā)現(xiàn),miR-281與DENV-2基因組5'-UTR序列存在相互作用�，F(xiàn)有的結(jié)果顯示登革病毒可能利用一個白紋伊蚊編碼的、病毒感染重要器官中腸組織特異性高表達(dá)的miRNA——miR-281增強(qiáng)病毒自身復(fù)制水平。其作用方式可能是通過與DENV-2基因組5'-UTR的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。據(jù)我們所知,這是第一次報(bào)道白紋伊蚊組織特異性miRNA對登革病毒復(fù)制的調(diào)控作用。未來我們還將繼續(xù)深入探討miR-281靶向自身的靶基因從而調(diào)節(jié)登革病毒復(fù)制的機(jī)制。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R512.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄭培明;吳錦雅;顧金保;屠志堅(jiān);陳曉光;;白紋伊蚊miRNA的分離、鑒定及表達(dá)譜的初步分析[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年04期

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本文編號：1789589