本文選題：結核分枝桿菌 + 結核病��； 參考：《北京市結核病胸部腫瘤研究所》2017年碩士論文

【摘要】：結核分枝桿菌是一種胞內(nèi)感染菌,故在體液免疫應答過程中產(chǎn)生的抗體對它的免疫作用較弱,而對細胞內(nèi)的結核分枝桿菌無作用,因此天然免疫在結核分枝桿菌的感染過程中起到非常重要的作用。自噬作為天然免疫應答中非常重要的一部分,參與眾多先天免疫信號的調(diào)控。自噬是低氧、營養(yǎng)缺乏、細胞器老化等各種原因導致的細胞的應激反應,自噬不僅能降解細胞內(nèi)老化的細胞器和蛋白質,還能清除細胞內(nèi)感染的細菌和病毒。自噬相關蛋白(autophagy related protein,ATG)之間互相協(xié)同,引起自噬體形成過程中的細胞膜變化,當抗原提呈細胞一旦吞噬了結核分枝桿菌由單層膜結構組成的吞噬囊泡在瞬間就會被LC3蛋白修飾,自噬蛋白相互激活修飾最終成熟為自噬小體,自噬小體與溶酶體互相融合形成自噬溶酶體,將吞噬的結核分枝桿菌降解。細胞的自噬除了對病原體具有直接的殺傷作用,而且自噬在抗原提成中發(fā)揮不可替代的作用,自噬作用可以促進位于自噬體表面的MHC-ΙΙ分子與病原微生物的抗原表位結合,并提呈給CD4+T細胞,自噬同時可以通過MHC-Ι將抗原提呈給CD8+T細胞。本研究收集了初治肺結核病患者和健康志愿者共24人,使用實時定量PCR的方法檢測了初治結核病患者(病例組)和健康志愿者(對照組)之間的自噬基因的水平,本研究發(fā)現(xiàn),對照組mTOR基因表達水平是病例組的(2.76±1.56)倍;對照組Rheb基因表達水平是病例組的(1.85±0.91)倍,可見初治結核病患者中這兩種基因表達下調(diào),可在一定程度上促進自噬水平,抵抗M.tb感染。除此之外,研究發(fā)現(xiàn)對照組BECN1基因表達水平是病例組的(2.23±1.52)倍,說明初治肺結核患者可以通過下調(diào)BECN1基因的表達從而抑制自噬的發(fā)生,通過這一基因水平的變化可以得出BECN1通路和mTOR通路對自噬的調(diào)節(jié)是不一致的,甚至有可能是相反的調(diào)節(jié)。本研究同時檢測了使用H37Rv感染THP-1細胞后自噬相關基因ATG5、ATG7、ATG12和Rheb在感染后30min、90min、4h、10h和24h的表達水平,研究發(fā)現(xiàn)ATG5、ATG7和ATG12在THP-1細胞感染H37Rv后30min后即表達上調(diào),ATG5和ATG7基因在感染10h左右達到了基因表達的最高峰,自噬的調(diào)節(jié)基因Rheb表達水平在實驗早期并沒有顯著的升高或者下降,在感染的時間段內(nèi)(30min到24h),自噬的基因Rheb表達水平與感染前相比變化在2倍以內(nèi),故可以認為在體外實驗中在H37Rv感染早期,Rheb基因沒有明顯變化;使用二甲雙胍干預后的THP-1細胞在感染了BCG菌株后,自噬相關基因Rheb的表達水平在實驗組(使用二甲雙胍干預)和對照組(不使用二甲雙胍干預)并沒有顯著的變化,而自噬相關基因mTOR在感染30min時有顯著的表達下調(diào),故二甲雙胍可能在THP-1細胞在感染了BCG菌株早期抑制了自噬基因mTOR表達;除此之外,使用活細胞工作站觀察使用BCG菌株感染后含有二甲雙胍和不含有二甲雙胍藥物的細胞中mRFP-GFP-LC3B的含量,發(fā)現(xiàn)二甲雙胍還可以促進自噬小體和溶酶體的融合,促進了THP-1細胞對BCG菌株的自噬。
[Abstract]:Mycobacterium tuberculosis is a kind of intracellular infection bacteria, so the antibody produced in the humoral immune response to it is weak, but it does not affect the Mycobacterium tuberculosis in the cell. Therefore, the natural immunity plays a very important role in the infection process of Mycobacterium tuberculosis. Autophagy is very important in the natural immune response. Part one participates in the regulation of numerous innate immune signals. Autophagy is the stress response of cells, such as hypoxia, nutritional deficiency, organelle aging and so on. Autophagy can not only degrade intracellular organelles and proteins, but also remove intracellular infection bacteria and diseases. Autophagy related protein (autophagy related protein, ATG) The cell membrane changes in the process of the formation of autophagosomes. Once the antigen presenting cells have phagocytic phagocytic vesicles composed of single layer membrane structure, the phagocytic vesicles of Mycobacterium tuberculosis are instantly modified by LC3 protein. Autophagic proteins interact with each other to mature into autophagic bodies, and autophagosomes and lysosomes are fused to form autophagy. The lysosome degrades the phagocytic Mycobacterium tuberculosis. Autophagy has a direct killing effect on the pathogen, and autophagy plays an irreplaceable role in the antigen preparation. Autophagy can promote the combination of the MHC- molecules on the surface of the autophagosome and the epitopes of the pathogenic microorganism, and present it to CD4+T cells and autophagy. At the same time, the antigen can be presented to CD8+T cells by MHC-. This study collected 24 patients with pulmonary tuberculosis and healthy volunteers. The level of autophagy gene was detected by real-time quantitative PCR. This study found that the mTOR gene expressed water in the control group. The level of the case group was (2.76 + 1.56) times, and the expression level of Rheb gene in the control group was (1.85 + 0.91) times that of the case group. It was found that the expression of these two genes was downregulated in the patients with primary TB, which could promote autophagy to a certain extent and resist M.tb infection. In addition, the study found that the expression level of BECN1 gene in the control group was (2.23 + 1.52) times that of the case group. It is suggested that the primary treatment of tuberculosis patients can inhibit the occurrence of autophagy by downregulating the expression of the BECN1 gene. Through the change of this gene level, the regulation of autophagy between the BECN1 pathway and the mTOR pathway is inconsistent, and may even be the opposite regulation. This study also detected the autophagy associated with the use of H37Rv infected THP-1 cells. The expression level of 30min, 90min, 4h, 10h and 24h after infection of the gene ATG5, ATG7, ATG12 and Rheb was found to be up and up after the infection of ATG5, ATG7 and ATG12. In the period of infection (30min to 24h), the expression level of autophagy gene Rheb is less than 2 times compared with that before infection. Therefore, it can be considered that in the early stage of H37Rv infection, the Rheb gene did not change obviously. The THP-1 cells using metformin after the infection of the BCG strain, the autophagy related gene Rhe. There was no significant change in the expression level of B in the experimental group (using metformin intervention) and the control group (without the use of metformin intervention), but the autophagy related gene mTOR decreased significantly in 30min infection, so metformin may inhibit the expression of autophagy gene mTOR in the early stage of the infection of the BCG strain of the BCG strain; in addition, The content of mRFP-GFP-LC3B in cells containing metformin and no metformin containing metformin after infection with BCG strain was observed with a live cell workstation. It was found that metformin also promoted the fusion of autophagosomes and lysosomes, and promoted autophagy of THP-1 cells to BCG.

【學位授予單位】：北京市結核病胸部腫瘤研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R52

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