本文選題：FHA結(jié)構(gòu)域 + 基因組穩(wěn)定性　； 參考：《西南大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的結(jié)核病嚴(yán)重威脅著人類健康,每年有上百萬(wàn)的人感染結(jié)核病,已經(jīng)成為死亡率僅次于艾滋病的全球第二大傳染病。在世界衛(wèi)生組織WHO已經(jīng)發(fā)布了最新的《2013年全球結(jié)核病報(bào)告》中指出：2012年新增結(jié)核病860萬(wàn)例,其中死亡人數(shù)到達(dá)了130萬(wàn)。其主要由于多重耐藥菌和廣泛耐藥菌的出現(xiàn),以及HIV的共感染,使得結(jié)核病形勢(shì)更加嚴(yán)峻。因此,對(duì)結(jié)核病的致病菌——結(jié)核分枝桿菌的深入研究迫在眉睫。 在各種環(huán)境脅迫下維持基因組的穩(wěn)定性是生物生存和繁殖的關(guān)鍵。結(jié)核菌是人類重大傳染疾病結(jié)核病的致病菌[1]。在分枝桿菌長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,又會(huì)遭遇各種環(huán)境壓力的選擇作用,比如：紫外線照射[2]。結(jié)核分枝桿菌為了在巨噬細(xì)胞和肉芽腫中存活,必須適應(yīng)有氧化壓力[3]。紫外線會(huì)使生物體DNA上兩個(gè)相連的胸腺嘧啶形成胸腺嘧啶二聚體,使DNA鏈發(fā)生斷裂,使復(fù)制酶無(wú)法工作,從而對(duì)生物體造成損傷[4]。氧化壓力是生物在有氧環(huán)境生存必須面對(duì)的一種壓力條件,通過(guò)影響Ca2+濃度引起DNA的損傷[5]。但是,在這么多不利條件下,結(jié)核分枝桿菌的基因組一直保持非常穩(wěn)定[6],那么維持基因組的穩(wěn)定性在分枝桿菌適應(yīng)外界壓力環(huán)境和侵染宿主細(xì)胞的過(guò)程中就顯得非常重要。 有關(guān)研究表明：分枝桿菌進(jìn)化出了一系列的修復(fù)和耐受機(jī)制來(lái)抵抗UV給DNA帶來(lái)的損傷。分析結(jié)核分枝桿菌基因組表明：其基因組含有DNA修復(fù)系統(tǒng),比如：DNA損傷修復(fù)、核算切除修復(fù)(NER)、基礎(chǔ)切除修復(fù)(BER)、重組修復(fù)、非同源末端連接、SOS修復(fù)等[7,8]。為了抵抗巨噬細(xì)胞和肉芽腫,結(jié)核分枝桿菌也具有抵抗活性氧調(diào)節(jié)的機(jī)制。在革蘭氏陰性菌中,OxyR蛋白是抵抗氧化壓力重要的組成成分[9]. OxyR是活性氧簇感應(yīng)器,同時(shí)也是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,包括去毒酶(過(guò)氧化氫酶和氫過(guò)氧化物酶)和alkyl氫過(guò)氧化物酶。雖然這幾十年來(lái)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的研究不斷深入,維持基因組穩(wěn)定性仍然有很多地方還有待研究。 FHA的全稱為forkhead-associated domain,是叉頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域,是許多調(diào)控蛋白的磷酸肽識(shí)別結(jié)構(gòu)域。包含有FHA結(jié)構(gòu)域的蛋白涉及許多細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的過(guò)程,包括細(xì)胞形態(tài)的調(diào)節(jié)、三型分泌系統(tǒng)、孢子形成、碳水化合物的儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和乙胺丁醇耐受以及致病菌與宿主之間的相互關(guān)系。在真核生物中,許多包含有FHA結(jié)構(gòu)域的蛋白分布在細(xì)胞核,參與細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的形成和維持,DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 本文研究的GarA蛋白(MSMEG_3647)是典型的含有磷酸化識(shí)別FHA結(jié)構(gòu)域的調(diào)控蛋白。有研究表明,未磷酸化GarA蛋白能與α-酮戊二酸脫羧酶(KGD)、依賴NAD的谷氨酸脫氫酶(GDH)、谷氨酸合酶的活性(GS)相結(jié)合并對(duì)其的活性產(chǎn)生影響[10]。在結(jié)核分枝桿菌中,GarA蛋白作為一個(gè)典型的FHA結(jié)構(gòu)域調(diào)控蛋白怎么可能只參與代謝功能的調(diào)控昵?本文利用Himarl轉(zhuǎn)座子插入突變庫(kù),成功篩選了本文篩選到了一株GarA (MSMEG_3647)蛋白突變的恥垢分枝桿菌M. smegmatis A GarA,其菌落形態(tài)與M. smegmatis mc2155相比明顯變得光滑,單菌落形態(tài)減小、疏水性系數(shù)明顯增高,生物膜形態(tài)也發(fā)生變化。這表明：GarA (MSMEG_3647)蛋白突變會(huì)引起細(xì)胞壁脂質(zhì)成分的變化。我們的實(shí)驗(yàn)還證明了GarA (MSMEG_3647)蛋白突變的恥垢分枝桿菌M. smegmatis A GarA對(duì)紫外線照射耐受及對(duì)H202敏感,其可能是與基因組穩(wěn)定性相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)了菌體內(nèi)游離氨基酸代謝及組分也發(fā)生了改變。本研究發(fā)現(xiàn)了一種UV和氧化壓力應(yīng)激的新型分子機(jī)制：GarA蛋白缺失會(huì)引起菌體內(nèi)氨基酸組分含量變化,從而導(dǎo)致菌體對(duì)紫外線及氧化壓力的耐受情況發(fā)生變化。
[Abstract]:Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis, MTB) caused by tuberculosis, a serious threat to human health, there are millions of people infected with TB each year, has become the world's second largest infectious disease mortality after AIDS. The WHO WHO has released the latest <2013 pointed out that the global TB report >: 2012 new 8 million 600 thousand cases of tuberculosis, including the death toll reached 1 million 300 thousand. It is mainly due to emergence of multiple drug resistant and extensively drug-resistant bacteria, and co infection of HIV and tuberculosis makes the situation even more severe. Therefore, further study of pathogenic bacteria of Mycobacterium tuberculosis tuberculosis disease is imminent.
Under various environmental stresses to maintain genome stability is the key to biological survival and reproduction. Mycobacterium tuberculosis is a major human infectious diseases, tuberculosis pathogenic bacteria [1]. in the evolutionary process of mycobacteria in the long history of the choice of the encounter various environmental stresses such as: ultraviolet irradiation [2]. of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and granuloma in order to survive, must adapt to the oxidative stress [3]. ultraviolet rays will make organisms DNA two connected two thymine formation of thymine dimers, break the DNA strands, the replicase cannot work, thus opposite objects cause oxidative [4]. damage stress is in a condition of biological pressure oxygen environment must face, through the influence of the concentration of Ca2+ caused by injury [5]. DNA but, in so many adverse conditions, the Mycobacterium tuberculosis genome has remained very stable [6], then maintain gene The stability of the group is very important in the process of Mycobacterium adaptation to the external stress environment and the infection of the host cells.
The study showed that: Mycobacterium evolved a series of repair and tolerance mechanisms to resist the damage caused by the DNA to UV. The analysis showed that the genome of Mycobacterium tuberculosis genome contains DNA repair system, such as: DNA repair, accounting for excision repair (NER), base excision repair (BER), recombination repair, non homologous end joining, SOS repair and [7,8]. to resist macrophages and Mycobacterium tuberculosis granuloma, also has a mechanism against ROS regulation. In gram negative bacteria. The OxyR protein is an important component of resistance to oxidative stress [9]. OxyR is ROS sensors, as well as a transcription factor, including detoxification enzymes (hydrogen peroxide the enzyme and hydrogen peroxidase) and alkyl hydrogen peroxidase. Although these decades of research on Mycobacterium tuberculosis continues, the maintenance of genomic stability there are still many places have yet to be Research.
The full name of FHA is forkhead-associated domain, is related to structure of forkhead domain, is to identify the structure of phosphopeptide domain. Many proteins contain FHA domain proteins involved in the metabolism of bacteria growth in many processes, including the regulation of cell morphology, type three secretion system, spore formation, carbohydrate storage, transport, the relationship between signal transduction and ethambutol resistance and pathogens and the hosts. In eukaryotes, many contain FHA domain protein located in the nucleus, involved in the formation and maintenance of cell cycle checkpoints, DNA repair and transcriptional regulation.
This paper studies the GarA protein (MSMEG_3647) is a typical regulatory protein containing phosphorylated FHA recognition domain. Studies have shown that the non phosphorylated GarA protein with alpha ketoglutarate decarboxylase (KGD), NAD dependent glutamate dehydrogenase (GDH), the activity of glutamate synthase (GS) combined to produce effect of [10]. in Mycobacterium tuberculosis on the activity regulation of Nick how could GarA protein as a typical FHA domain proteins participate only in metabolic function? The Himarl transposon insertion mutant library, this paper successfully screened screened an GarA protein (MSMEG_3647) mutations in Mycobacterium smegmatis M. smegmatis A GarA, M. smegmatis mc2155 and its colony morphology obviously becomes smooth, reduce the single colony morphology, hydrophobicity coefficient increased obviously, biofilm morphology is changed. This indicated that GarA (MSMEG_3647) protein mutation will lead Changes in cell wall lipid composition. The results also show that GarA (MSMEG_3647) protein mutation in Mycobacterium smegmatis M. smegmatis A GarA on the ultraviolet radiation tolerant and sensitive to H202, which may be related to genomic stability. We also found the free amino acid metabolism in bacteria and its components have changed this study found. A new molecular mechanism of UV and oxidative stress: loss of GarA protein can cause bacteria in amino acid composition content change, which leads to the tolerance of bacterial UV and oxidative stress change.

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R52

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