發(fā)布時(shí)間：2018-04-18 09:18

  本文選題：包蟲病 + 己糖激酶��； 參考：《蘭州大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景：包蟲病(Echinococcosis)是由棘球絳蟲(Echinococcus)后絳幼蟲棘球蚴寄生于人體或宿主動(dòng)物而引起的嚴(yán)重疾病。我國是包蟲病發(fā)病率較高的國家,同時(shí)有囊型和泡型兩種類型的包蟲病。阿苯達(dá)唑是目前臨床應(yīng)用最廣泛的抗包蟲病藥物,但是該藥腸道吸收率差,其只能抑制寄生蟲生長,而不能有效殺滅寄生蟲,患者必須長期大量服用該藥物才能達(dá)到治療效果。臨床研究發(fā)現(xiàn)其平均治愈率僅有30%,并且該藥可引起多系統(tǒng)的嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)(serious adverse drug reactions, SADR),如腦炎綜合征(急性脫髓鞘腦炎)、消化功能紊亂、急性肝損傷、癲癇、溶血性貧血、腎衰、過敏性休克、嚴(yán)重藥疹等。另外,持續(xù)幾十年的使用,包蟲對阿苯達(dá)唑產(chǎn)生耐藥性的問題也愈來愈嚴(yán)重。因此,尋找或開發(fā)療效顯著且副作用小的包蟲病治療新藥物具有重大的意義,是當(dāng)務(wù)之急。新的治療藥物的研制有賴于對寄生蟲蟲體生物學(xué)的全面解析。目前,細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus, E.granulosus)和多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis, E.multilocularis)全基因組測序工作已經(jīng)完成,另外Genbank (NCBI)數(shù)據(jù)庫中亦包含了多條來源于E.granulosus和E.multilocularis原頭節(jié)和生發(fā)層組織的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Squence Tag, EST)。包蟲基因組學(xué)和功能基因組研究為完全解析蟲體的生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也加快了尋找或開發(fā)新的抗包蟲病藥物的進(jìn)程。在包蟲生活史中,通過人為阻斷或抑制蟲卵入侵至蟲卵成熟之間的任何發(fā)育階段,都具有控制或減輕病情和阻斷傳播的實(shí)際意義,包蟲生活史的各個(gè)階段,如蟲卵、幼蟲、成蟲等均可作為包蟲病藥物作用的靶標(biāo)。呂剛等人構(gòu)建了E.granulosus成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫,這為開展對E.granulosus成蟲階段基因的研究和篩選、分離、鑒定E.granulosus生長發(fā)育關(guān)鍵分子及潛在藥物靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。 研究方法：對己成功構(gòu)建的E.granulosus成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫進(jìn)行大規(guī)模5'EST隨機(jī)消減測序,注釋所獲得的高通量數(shù)據(jù),對EST進(jìn)行功能分類及代謝途徑分析,在已有的包蟲功能基因組學(xué)研究基礎(chǔ)上,分析E.granulosus生長發(fā)育關(guān)鍵分子及潛在藥物靶點(diǎn)。結(jié)合已有物種糖酵解及磷酸戊糖代謝途徑相關(guān)基因的研究現(xiàn)狀,篩選E.granulosus中參與該兩條代謝途徑的部分重要基因。通過生物信息學(xué)技術(shù)分析所獲得的E.granulosus糖酵解關(guān)鍵酶-己糖激酶(Hexokinase,EgHK)和磷酸戊糖途徑關(guān)鍵酶-轉(zhuǎn)醛醇酶(Transaldolase,瀛TAL)的全長基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)。利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建BL21-pET30a-EgTAL和BL21-pET30a-EgHK原核表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)、表達(dá)及純化,研究其酶學(xué)特性。將純化EgHK和EgTAL蛋白免疫BALB/c小鼠以獲得特異性多克隆抗體,通過western-blot方法鑒定蛋白,并采用免疫組織化學(xué)染色對EgHK和TAL在細(xì)粒棘球蚴組織的表達(dá)進(jìn)行定位分析。在以上研究基礎(chǔ)上,選取多種糖酵解途徑酶抑制劑,如3-溴丙酮酸(3-Bromopyruvate)、氯尼達(dá)明(Lonidamine)、2-脫氧葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose)、氯舒隆(Clorsulon)、2,6-二羥基萘(2,6-dihydroxynaphthalene)、草氨酸鈉(Sodium oxamate)、6-氨基煙酰胺(6-aminonicotinamide)、奧硝唑(Ornidazole)以及磷酸戊糖代謝途徑抑制劑羥基硫胺素(Oxythiamine chloride hydrochloride),同時(shí)選取中藥蛇葡萄素,進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究其抗細(xì)粒棘球蚴和泡球蚴的作用。建立小鼠泡球蚴感染模型,連續(xù)六周口服給予小鼠3-溴丙酮酸治療,評價(jià)其抗泡球蚴效果。通過體外培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞,利用MTT比色法分析比較3-溴丙酮酸、蛇葡萄素以及阿苯達(dá)唑?qū)θ苏８渭?xì)胞的毒性作用。另外以BALB/c小鼠為模型,口服給予有效抗包蟲治療劑量的3-溴丙酮酸和阿苯達(dá)唑六周后,通過檢測肝腎功能生化指標(biāo)以及組織病理鏡檢分析其對小鼠正常肝臟和腎臟的不利影響。 研究結(jié)果：本研究從E.granulosus成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫中隨機(jī)挑選克隆進(jìn)行測序,共得到了1560條unigenes,與NCBI的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)了155條E.granulosus特有的新基因。將Unigenes利用國際標(biāo)準(zhǔn)分類體系Gene Ontology (GO)進(jìn)行分類后,其中所占比例最高的是“結(jié)合活性”(Binding)和“催化活性”(Catalytic activity),分別為23.33%和3.45%。將Unigenes經(jīng)過KEGG注釋,發(fā)現(xiàn)了227條代謝途徑,分析可見糖酵解途徑的基因表達(dá)豐度較高,提示該途徑中的基因可能作為潛在的抗包蟲藥物靶點(diǎn)。生物信息學(xué)分析預(yù)測表明EgHK和EgTAL有一系列重要的藥靶特征。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中,EgHK和EgTAL分別以包涵體和可溶性形式表達(dá),經(jīng)過Ni離子親和層析柱得到了高純度的蛋白。用純化的EgHK和EgTAL免疫BALB/c小鼠獲得了較高滴度的多克隆抗體,Western-blot鑒定表明重組蛋白EgHK和瀛TAL具有免疫原性和免疫反應(yīng)性。免疫組織化學(xué)定位顯示EgTAL及EgHK在原頭節(jié)及囊壁組織均廣泛表達(dá)。在眾多的糖酵解抑制劑當(dāng)中,己糖激酶抑制劑3-溴丙酮酸抗細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴的作用效果最強(qiáng),在作用濃度為40μM時(shí),其作用強(qiáng)于阿苯達(dá)唑(P0.05)。3-溴丙酮酸通過口服途徑治療泡球蚴感染小鼠有明顯的治療效果,與未治療組相比,泡球蚴組織囊塊濕重明顯減輕(P0.05)。不同濃度的3-溴丙酮酸能夠不同程度的抑制重組EgHK蛋白的催化活性,表明3-溴丙酮酸是通過抑制E.granulosus的HK而發(fā)揮抗包蟲作用的。中藥蛇葡萄素也顯示了較好的抗包蟲作用,濃度為160μM時(shí),作用7天后原頭節(jié)存活率為1.5%,該作用效果與40μM阿苯達(dá)唑相當(dāng)。蛇葡萄素濃度為400μM、800μM、1000μM時(shí),抗泡球蚴作用明顯強(qiáng)于40μM阿苯達(dá)唑(p0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3-溴丙酮酸和蛇葡萄素對人正常肝細(xì)胞均有毒性作用,在有效抗泡球蚴作用濃度下,阿苯達(dá)唑?qū)Ω渭?xì)胞的毒性作用最大,3-溴丙酮酸和蛇葡萄素的毒性作用小于阿苯達(dá)唑。BALB/c小鼠體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)表明3-溴丙酮酸和阿苯達(dá)唑在有效抗泡球蚴作用濃度下對腎臟功能無明顯影響,阿苯達(dá)唑可引起較嚴(yán)重的肝組織損傷,血清中堿性磷酸酶(ALP)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量升高,谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量為148.000士27.475U/L,顯著高于正常對照組AST值(115.500±18.355U/L)(P0.05),病理組織鏡檢呈慢性肝炎樣變,而3-溴丙酮酸則未引起明顯的肝臟損傷。 結(jié)論：本研究首次完成了對E.granulosus成蟲cDNA文庫EST的分析,豐富并發(fā)展了E.granulosus基因組學(xué)的研究,為尋找或開發(fā)抗E.granulosus新藥物奠定了基礎(chǔ)。通過對E.granulosus基因組信息的挖掘,研究了其高豐度表達(dá)基因EgHK和EgTAL及其編碼蛋白的特性,揭示了其作為潛在藥物靶標(biāo)的可能性。在此基礎(chǔ)上,選取多種糖酵解以及磷酸戊糖途徑抑制劑,同時(shí)選取中藥蛇葡萄素,通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評價(jià)其抗包蟲效果。糖酵解酶HK抑制劑3-溴丙酮酸和蛇葡萄素具有較好的抗棘球蚴和泡球蚴作用,并且初步研究表明3-溴丙酮酸毒副作用小于阿苯達(dá)唑,3-溴丙酮酸和蛇葡萄素有望成為抗包蟲候選新藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R532.32

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1767737