本文選題：結(jié)核分枝桿菌 + 計算機預(yù)測�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：背景：結(jié)核病仍是一個致死性傳染病,全球有三分之一的人口潛在性感染結(jié)核,更有三分之一的結(jié)核病人未得到診斷和治療。目前對肺結(jié)核病人的診斷仍然依賴于細菌學(xué)方法,比如痰涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng),而這些方法遠遠不能滿足臨床病人的需要。為控制結(jié)核病,WHO全球行動計劃的主要焦點是發(fā)展簡單和節(jié)省費用的診斷方法,以提高病例的檢測。但是目前結(jié)核病診斷仍缺乏精確迅速的POINT-OF-CARE (POC)診斷測試。因此迫切需要尋找特異性好、敏感性高的分子靶標(biāo)以及發(fā)展相應(yīng)的費用低廉的快速床旁診斷測試,這有利于結(jié)核病能夠得到早期的診斷、治療和疫情控制。本研究采用生物信息學(xué)與實驗方法相結(jié)合,鑒定和評價適合用于結(jié)核病診斷的分子靶標(biāo),建立高靈敏度和特異性且對儀器依賴程度低的結(jié)核分枝桿菌快速檢測方法。方法：1.通過對結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)全基因組序列分析,檢測Mtb必需基因序列單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)和插入／缺失(insertion/deletions, Indels)。篩選SNPs、indels發(fā)生率盡可能低的必需基因,作為結(jié)核病的潛在分子診斷靶標(biāo)。本研究從這些候選基因中選擇clpP2基因進行驗證。2.采用生物信息學(xué)方法詳細評價Mtb clpP2基因的診斷潛能。計算分枝桿菌屬clpP2基因核苷酸組成、密碼子偏性、變異性,對clpP2基因DNA多態(tài)性進行了分析,推測clpP2基因發(fā)生HGT事件可能性。構(gòu)建clpP2基因分子進化樹,評價clpP2基因?qū)tb與非結(jié)核分枝桿菌的區(qū)分能力。通過同源對比分析,從信息學(xué)角度評價clpP2基因靶標(biāo)的種屬特異性。3.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法(Loop Mediated Isothermal Amplification, LAMP),是一種新的核酸擴增方法,己廣泛用于床旁(Point-of-care)測試。本研究以結(jié)核分枝桿菌clpP2基因為靶標(biāo),建立可視LAMP檢查方法,在本研究中將其命名為可視clpP2-LAMP。本實驗對clpP2-LAMP反應(yīng)條件進行優(yōu)化,評價clpP2-LAMP敏感性和特異性及在臨床標(biāo)本檢測中的應(yīng)用價值。4.從信息學(xué)角度推測Mtb ClpP2蛋白用于結(jié)核病的診斷應(yīng)該具有一定的特異性,因此本研究原核表達Mtb ClpP2蛋白,制備anti-ClpP2兔多克隆抗體,對ClpP2蛋白在細胞內(nèi)的亞定位、不同應(yīng)激條件下細菌體內(nèi)的表達水平、免疫特性進行了分析,進一步測定結(jié)核病人血清中ClpP2蛋白及抗體水平,分析其在臨床中的應(yīng)用價值。結(jié)果：1.從H37Rv基因組中共下載61 5個必需基因,利用GMTV (Genome-wide Mycobacterium tuberculosis variation)數(shù)據(jù)庫對這些必需基因序列進行SNPs、 indels進行分析,將SNPs和indels發(fā)生率均1%的必需基因作為潛在的診斷靶標(biāo),共篩選到45個必需基因。clpP2基因具有很低的單核苷酸多態(tài)性和種屬特異性,是本研究進一步研究的靶標(biāo)分子。2.對分枝桿菌屬clpP2基因進行了較為詳盡的序列分析：(1)對其核苷酸組成、密碼子偏性、變異性及DNA多態(tài)性進行了分析,表明clpP2基因高度保守,不易發(fā)生HGT事件；(2)分析Mtb的clpP2基因同源序列,在呼吸道非Mtb病原體基因組中沒有發(fā)現(xiàn)同源核酸序列,而編碼氨基酸序列進行對比,同源程度大約為50%左右,該結(jié)果表明clpP2基因用作分子診斷靶標(biāo)具有很好的特異性；(3)構(gòu)建了clpP2基因進化樹,clpP2進化樹的拓撲結(jié)構(gòu)與16s rRNA的拓撲結(jié)構(gòu)相似,但是進化距離明顯比16s rRNA的進化距離大,能夠?qū)tb與非結(jié)核分枝桿菌屬區(qū)分。3.基于Mtb clpP2基因,成功建立了可視的clpP2-LAMP法。clpP2-LAMP法的敏感性高于普通PCR 100倍,用87株分枝桿菌和18株非分枝桿菌驗證clpP2-LAMP法的準(zhǔn)確性,準(zhǔn)確性為100%。將clpP2-LAMP法直接用于臨床標(biāo)本的檢測,共檢測152例,與“金標(biāo)準(zhǔn)”培養(yǎng)法結(jié)果相比符合度為98%。4.成功克隆和重組Mtb ClpP2蛋白酶在大腸桿菌中表達。結(jié)果表明,Mtb ClpP2蛋白酶有較強的免疫原性,可刺激機體產(chǎn)生多克隆抗體。肺結(jié)核患者血清ClpP2抗原和抗體水平均增加。CIpP2抗原對結(jié)核病診斷ROC曲線下的面積(AUC)為0.911,敏感性為72.2%,特異性為91.3%。結(jié)論：經(jīng)過生物信息學(xué)分析,Mtb clpP2基因高度保守,具有種屬特異性,是潛在的結(jié)核病診斷的新靶標(biāo),是已知分子標(biāo)志物的補充。以Mtb clpP2基因為靶標(biāo)建立的LAMP結(jié)核檢測方法,以及以Mtb ClpP2蛋白酶為基礎(chǔ)的血清診斷方法在臨床標(biāo)本應(yīng)用中具有較高的價值。
[Abstract]:Background : Tuberculosis is still a fatal infectious disease . One third of the world ' s population is potentially infected with tuberculosis , and more than one third of the tuberculosis patients are not diagnosed and treated . The clpP2 gene was cloned from H37Rv . The results were as follows : 1 . The clpP2 gene was used as a target to evaluate the potential of clpP2 - mediated isothermal amplification .
( 2 ) The homologous sequence of the clpP2 gene of Mtb was analyzed . No homologous nucleic acid sequence was found in the genome of non - Mtb pathogen of respiratory tract , but the homology degree was about 50 % . The results showed that the clpP2 gene was used as molecular diagnostic target with good specificity .
The results showed that the Mtb clpP2 gene was highly conserved and the specificity was 91.3 % . The results showed that the Mtb clpP2 gene was highly conserved and the specificity was 91.3 % . The results showed that the Mtb clpP2 gene was highly conserved and the specificity was 91.3 % .

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R52

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本文編號：1753976