本文選題：HIV-1 + B細胞��； 參考：《復旦大學》2013年碩士論文

【摘要】：背景：人類免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus type1, HIV-1)感染會造成嚴重的免疫功能損傷,除了CD4+T細胞的不斷耗損和功能損傷,HIV-1感染也能導致嚴重的體液免疫應答缺損。有報道稱HIV-1感染者外周血B細胞數(shù)目減少,B細胞的亞群比例也出現(xiàn)紊亂,其中活化、耗竭和終末分化的B細胞亞群以及未成熟/過渡型B細胞增加,而CD27+記憶B細胞減少。B細胞表面活化分子、耗竭分子和凋亡分子表達增高,而抗凋亡分子表達降低,出現(xiàn)多克隆活化和抗原反應性低等功能損傷現(xiàn)象。這些研究進展多采用不同地區(qū)、以及不同疾病進展階段的感染者為研究對象,病毒的分子特征也存在差異性。尤其是ART后長期存活的感染者處于慢性感染的過程中,這部分人的B細胞亞群的表型和功能損傷的免疫學特征與機制、以及上述它們與疾病進展相關性等均有待深入探索,以建立有效的免疫干預策略,修復B細胞的表型異常與功能損傷。 本研究選取中國1995-1996年因有償獻血而集中形成的HIV-1長期慢性感染人群為研究對象,該人群的人口學特征、遺傳背景、以及病毒分子特征均相近,以期在上述研究方向上有所突破。 方法：按照知情同意的原則招募研究對象,分為3組：HIV感染未進行抗病毒治療組(HIV-viremic,簡稱VI), HIV感染接受ART組(HIV-aviremic,簡稱AV),與HIV-1陰性健康組(HIV-negative,簡稱HN)。采集HIV-1慢性感染者和HIV-1陰性健康人靜脈血分離外周血單個核細胞(PBMC)。 首先進行B細胞表面分子染色以界定B細胞亞群：未成熟B細胞(CD19+CD10+CD27)、初始B細胞(CD19+CD10-CD21+CD27-)、靜息記憶B細胞(CD19+CD10-CD21+CD27+)、活化記憶B細胞(CD19+CD10-CD21-CD27+)、組織樣記憶B細胞(CD19+CD10-CD21-CD27-)和漿母細胞(CD19+CD10-CD21-CD27+CD20-)。同時分析活化分子(CD38)、細胞增殖分子(Ki-67)、凋亡相關分子(CD95、Bcl-2和PD-1)以及共刺激分子(CD40和CD70)的表達。利用流式細胞儀檢測上述標志性分子的表達以及ART對B細胞表型的修復作用。 隨后,利用免疫磁珠負選法分選B細胞,進行B細胞功能性研究：用酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISpot)檢測抗原特異性(包括HIV-1膜蛋白gp120和流感膜蛋白HA特異性)的抗體分泌細胞表達水平；利用CBA(Cytometric Beads Assay)檢測細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的分泌水平。 結果：所招募的HIV-1慢性感染者的外周血CD4+T細胞和B細胞數(shù)目都顯著低于HN組(422±33個/μ1vs814±57個/μ1,p0.01；156±19個/μl vs216±33個/μ1,p=0.05),在VI二者顯著正相關(r=0.376,p=0.037),經(jīng)ART后CD4+T細胞和B細胞數(shù)目有所恢復。VI組與HN組相比,B細胞亞群變化顯著,未成熟B細胞、初始B細胞、靜息記憶B細胞和漿母細胞顯著降低,而組織樣記憶B細胞顯著增加,并且AV組初始B細胞和組織樣記憶B細胞比例都有所恢復,但是靜息記憶B細胞比例卻沒有恢復。 HIV-1感染后,B細胞以及未成熟B細胞、初始B細胞、靜息記憶B細胞和組織樣記憶B細胞4個亞群上調(diào)表達活化分子CD38,和細胞增殖分子Ki-67的表達呈正相關(r=0.432,p0.01)。凋亡分子CD95在靜息記憶B細胞、活化記憶B細胞和漿母細胞上的表達水平較高；而抗凋亡分子Bcl-2的表達在初始B細胞、組織樣記憶B細胞和漿母細胞3個亞群上顯著降低；同時靜息記憶B細胞和漿母細胞上調(diào)表達PD-1。共刺激分子CD40在所有B細胞亞群上的表達強度降低,而初始B細胞、靜息記憶B細胞、活化記憶B細胞和組織樣記憶B細胞上CD70的表達水平顯著降低。HIV-1感染引起B(yǎng)細胞及其亞群上活化分子、凋亡分子以及共刺激分子的異常表達經(jīng)抗病毒治療后獲得部分恢復。 HIV-1慢性感染者B細胞功能損傷明顯,Total IgG抗體分泌細胞(antibody-secreting cells, ASCs)由HN組的10600±2623ASCs/106B細胞顯著減少至IV組的3818±931ASCs/106B細胞(p=0.05),且流感蛋白特異性ASCs也顯著低于HN(22±7ASCs/106B細胞vs53±10ASCs/106B細胞,p=0.028),ART后改善不明顯。HIV-1膜蛋白特異性ASCs在HIV-1感染后升高(163±58ASCs/106B細胞),抗病毒治療后顯著降低(30±8ASCs/106B細胞,p0.01)。同時,HIV-1感染者B細胞分泌炎癥細胞因子IL-10、IL-6和IL-8,以及LT-α和趨化因子CCL-3的能力顯著低于健康人對照,ART并不能恢復B細胞分泌細胞因子的能力。 結論：HIV-1長期慢性感染造成外周血B細胞數(shù)目減少以及亞群比例的變化,并且B細胞亞群表現(xiàn)出過度活化,極易發(fā)生凋亡以及B-T細胞相互作用受損等多種損傷表型。HIV-1長期慢性感染造成B細胞功能損傷,表現(xiàn)在抗原特異性抗體分泌細胞減少和細胞因子分泌能力降低。ART僅能部分修復HIV-1慢性感染者B細胞表型和功能的損傷。
[Abstract]:BACKGROUND : Human immunodeficiency virus type 1 ( HIV - 1 ) infection can cause severe immune function damage . In addition to the increasing of CD4 + T cells and the impairment of function , HIV - 1 infection can lead to severe humoral immune response .

In this study , the population of HIV - 1 chronically infected with HIV - 1 in China from 1995 to 1996 was studied . The demographic characteristics , genetic background and viral molecular characteristics of the population were similar , with a view to making a breakthrough in the research direction .

Methods : The subjects were recruited according to the principle of informed consent , divided into 3 groups : HIV - viremic ( VI ) , HIV - aviremic , and HIV - 1 negative health group ( HN ) . Peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) were isolated from peripheral blood of HIV - 1 chronic infection and HIV - 1 negative healthy human venous blood .

First , B - cell surface molecule staining was performed to define B - cell subsets : immature B - cells ( CD10 + CD27 ) , initial B - cells ( CD19 + CD10 - CD21 + CD27 + ) , resting memory B cells ( CD19 + CD10 - CD21 + CD27 + ) , tissue - like memory B cells ( CD19 + CD10 - CD21 - CD27 + ) , tissue - like memory B cells ( CD19 + CD10 - CD21 - CD27 + ) , and costimulatory molecules ( CD10 - CD21 - CD27 + CD20 - ) .

Subsequently , B cells were sorted by negative selection with immunomagnetic beads to perform the functional study of B cells : antibody secretion cell expression levels of antigen specificity , including HIV - 1 membrane protein and influenza - membrane protein HA - specific ) , were detected by enzyme - linked immunodot assay ( ELISA ) .
The level of cytokine secretion in the culture supernatant was detected using the CBA ( Cytometric Assay Assay ) .

Results : The number of CD4 + T cells and B cells in peripheral blood of HIV - 1 patients were significantly lower than that in HN group ( 422 鹵 33 / 渭1 vs 814 鹵 57 / 渭1 , p0.01 ) .
There was significant positive correlation between group VI and HN group ( r = 0.376 , p = 0.037 ) , and the number of CD4 + T cells and B cells increased significantly after ART ( r = 0.376 , p = 0.037 ) .

After infection with HIV - 1 , B cells and immature B cells , initial B cells , resting memory B cells and tissue - like memory B cells up - regulated the expression of activated molecule CD38 and the expression of Ki - 67 in cell proliferation molecules ( r = 0.432 , p0.01 ) . The expression level of apoptotic molecules CD95 in resting memory B cells and activated memory B cells and plasma cells was higher .
The expression of anti - apoptotic molecules Bcl - 2 decreased significantly in the initial B cells , the tissue - like memory B cells , and the 3 subgroups of the plasma cells ;
At the same time , the expression level of CD70 in B cells and plasma cells decreased significantly , while the level of CD70 expression in B cells , resting memory B cells , activated memory B cells and tissue - like memory B cells decreased significantly . The abnormal expression of activated molecules , apoptotic molecules and co - stimulatory molecules on B cells and their sub - populations caused by HIV - 1 infection was partially recovered after antiviral treatment .

Anti - HIV - 1 membrane protein - specific ASCs were significantly lower than HN ( 22 鹵 7ASCs / 106b cells vs 53 鹵 10ASCs / 106b cells , p = 0.028 ) . The anti - HIV - 1 membrane protein - specific ASCs increased after HIV - 1 infection ( 163 鹵 58ASCs / 106b cells ) and decreased significantly after antiviral therapy ( 30 鹵 8ASCs / 106b cells , p0.01 ) . At the same time , the IL - 10 , IL - 6 and IL - 8 secretion of IL - 10 , IL - 6 and IL - 8 , as well as LT - 偽 and chemokine CCL - 3 , were significantly lower than those of healthy controls , and ART did not restore the ability of B cells to secrete cytokines .

Conclusion : Chronic infection of HIV - 1 caused the decrease of the number of B cells in peripheral blood and the change of the proportion of B - T cells , and the B - cell subsets showed a variety of damage phenotype , such as excessive activation , apoptosis and impaired B - T cell interaction .

【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.91

【共引文獻】

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本文編號：1746713