發(fā)布時間：2018-04-12 07:48

  本文選題：登革病毒 + EDⅢ蛋白　； 參考：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:登革病毒(Dengue virus,DENV)包膜蛋白第Ⅲ結(jié)構(gòu)域(Envelope domainⅢ,EDⅢ)介導(dǎo)病毒吸附感染受體細(xì)胞,并刺激機(jī)體產(chǎn)生針對DENV的型特異性抗體。二次異型DENV感染時,由于抗體依賴感染增強(qiáng)作用(Antibody dependent enhancement,ADE),體內(nèi)存在的登革病毒抗體會導(dǎo)致感染增強(qiáng)并誘發(fā)重癥登革熱(Severe dengue fever,SD)。通過檢測登革熱(Dengue fever,DF)患者體內(nèi)已存在的抗體型別,結(jié)合本次感染的病毒型別,判斷是否發(fā)生二次異型感染,可用于評估患者發(fā)展為重癥登革熱的風(fēng)險。目前,登革病毒血清抗體分型可以通過蝕斑減少中和實(shí)驗(Plaque reduction neutralization test,PRNT)實(shí)現(xiàn),但由于PRNT技術(shù)操作繁雜且耗時,主要局限在科研中應(yīng)用。因此臨床急需建立一種能簡單、快速對登革病毒血清型特異性抗體分型的新技術(shù)。本研究擬通過原核基因工程技術(shù)獲得登革病毒EDⅢ重組蛋白,建立ELISA檢測方法對登革病毒血清特異性抗體分型,并初步評價該方法的診斷效果。為今后應(yīng)用于臨床DF患者病情的評估,預(yù)測重癥登革熱的發(fā)病風(fēng)險以及對登革熱流行地區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。方法:1.利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增登革1型和2型病毒EDⅢ基因,構(gòu)建原核基因表達(dá)載體pET28b-EDⅢ,轉(zhuǎn)化BL21后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)鑒定重組蛋白,采用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白。2.利用高碘酸鈉法對登革1型和2型病毒EDⅢ重組蛋白進(jìn)行辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記,經(jīng)凝膠過濾層析純化酶標(biāo)記蛋白。3.建立登革1型和2型病毒血清抗體分型檢測的雙抗原夾心ELISA法,對抗原包被濃度、酶標(biāo)抗原濃度、標(biāo)本稀釋度以及顯色時間等條件進(jìn)行優(yōu)化。4.利用自建的分型ELISA法檢測登革熱患者恢復(fù)期血清標(biāo)本,與登革病毒IgG抗體檢測試劑盒和PRNT方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較,評估登革1型和2型病毒血清抗體分型ELISA方法檢測性能。成果:1.成功誘導(dǎo)表達(dá)登革1型和2型病毒EDⅢ重組蛋白,兩種重組蛋白均主要以包涵體蛋白形式表達(dá);MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果顯示兩種重組蛋白分別是登革1型和2型病毒EDⅢ蛋白;采用鎳親和層析技術(shù)獲得高純度的重組蛋白。2.利用高碘酸鈉法獲得酶標(biāo)記蛋白EDⅢ-HRP,并通過凝膠過濾層析法成功純化了酶標(biāo)記蛋白EDⅢ-HRP。3.建立了登革1型和2型病毒血清抗體分型檢測的雙抗原夾心ELISA法,方法條件優(yōu)化結(jié)果顯示最佳抗原包被濃度和酶標(biāo)抗原濃度均為1μg/mL,血清最佳稀釋度為1:40,最佳顯色時間為20min。4.48例登革1型病毒感染患者恢復(fù)期血清標(biāo)本,登革病毒IgG ELISA檢測試劑盒和自建1型IgG ELISA檢測陽性率均為83.3%(40/48),低于PRNT的陽性率(95.8%);自建1型IgG ELISA和PRNT之間存在相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)R2為0.4590,P0.01。11例登革2型病毒感染患者恢復(fù)期血清標(biāo)本,自建2型IgG ELISA檢測的陽性率為81.8%(9/11),高于登革病毒IgG檢測ELISA試劑盒陽性率(45.5%)。自建1型IgG ELISA和2型病毒感染患者血清之間的交叉反應(yīng)為22.9%(11/48),自建2型IgG ELISA和1型病毒感染患者血清之間的交叉反應(yīng)為45.5%(5/11),總交叉反應(yīng)為27.2%(16/59)。結(jié)論:成功建立了 DENV1和DENV2血清抗體分型ELISA檢測方法,對登革熱患者血清中的分型抗體的檢測均具有高度的敏感性,有可能成為DF血清抗體分型診斷和血清流行病學(xué)調(diào)查的有效工具,為登革病毒血清抗體分型的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R512.8;R446.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1738844