本文選題：惡性瘧原蟲 + solexa測序��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2013年博士論文

【摘要】：瘧疾目前仍然嚴重危害人類的健康，全球每年死于瘧疾的人數(shù)超過一百萬。在感染人體的四種瘧原蟲中，惡性瘧原蟲感染可引起重癥瘧疾，包括腦型瘧和妊娠相關性瘧疾。導致重癥瘧疾的病理基礎是惡性瘧原蟲感染的紅細胞（iRBC）粘附血管內皮細胞繼而堵塞腦部毛細血管或黏附在子宮毛細血管部位。研究已經(jīng)表明，這種黏附作用主要是由一種被稱為惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白1(PfEMP1)的分子介導的，該分子能與宿主體內20多種受體分子結合，是惡性瘧原蟲關鍵的致病因子。 PfEMP1蛋白是由惡性瘧原蟲var基因家族編碼的產(chǎn)物，該基因系變異基因家族，在惡性瘧原蟲3D7株基因組中含有約60個var基因，分布在不同染色體的亞端�；蛑虚g位置上。Var基因的結構包括啟動子區(qū)(5′UTR)、外顯子I、內含子、外顯子Ⅱ和下游調控區(qū)(3′UTR)。根據(jù)上游啟動子序列的不同，這60個var基因又可分為5個亞類：10個upsA亞類、35個upsB亞類、13個upsC亞類、1個upsD亞類(var假基因)和1個upsE亞類。大量現(xiàn)場和實驗室的研究表明，var基因轉錄的類型與惡性瘧原蟲的致病力（毒力）密切相關�；趷盒辕懺x3D7標準株的研究表明，var基因的表達具有排他性，即var基因家族每次只有一個獲得表達，剩余成員都處于沉默狀態(tài)，從而保護其有限的PfEMP1抗原庫不被人體免疫系統(tǒng)完全識別。大量研究已證明，這種排他性表達主要受到基因轉錄水平上的調控，其機制涉及細胞核內結構、染色質修飾、非編碼區(qū)等表觀遺傳學因素。而且惡性瘧原蟲的var基因能夠進行表達更替（expression switching），通過這種克隆變異機制不斷改變其所寄生的紅細胞膜表面抗原類型，從而在宿主體內實現(xiàn)免疫逃避。但是對于var基因表達更替的規(guī)律及其機制，目前尚無明確的結論�；趯嶒炇蚁x株的研究顯示，var基因的更替并非隨機的，而是具有高度的有序性和保守性，起始優(yōu)勢的var基因決定了后續(xù)表達的var基因類型；此外，對于某個var基因，其轉錄上調或者下調的速率也是固定的。 盡管var基因表達規(guī)律及其調控機制的研究一直是瘧疾基礎研究的熱點，但是迄今這方面的研究成果大多來自實驗室長期培養(yǎng)的蟲株，如3D7標準株等。一些研究顯示，惡性瘧原蟲經(jīng)歷體外長期培養(yǎng)后，由于寄生環(huán)境的改變和宿主免疫壓力的缺失，導致某些蟲體特征發(fā)生改變，包括被感染紅細胞表面knob‖結構的消失、強毒力相關的upsA亞類var基因快速沉默等。這些現(xiàn)象提示，對實驗室標準蟲株var基因研究獲得的相關結論未必能反映野生型蟲株中的實際情況，因此，開展惡性瘧原蟲野生型蟲株var基因轉錄表達機制的研究顯得十分必要。但是由于不同蟲株間var基因序列高度變異，同源性小于50%，給野生株var基因序列信息的獲得帶來了困難，阻礙了對惡性瘧原蟲野生株var基因家族的研究。對此，本研究選用中緬邊境地區(qū)新分離的惡性瘧原蟲野生蟲株，通過有限稀釋克隆法獲得野生蟲株的克隆品系，并利用全基因組測序和var基因拼接獲得野生型克隆的var基因序列。隨后，我們依此設計每個var基因的特異性引物，用于檢測和分析惡性瘧原蟲野生株的var基因轉錄變化規(guī)律，取得了以下研究結果： 1.惡性瘧原蟲野生株FCYN0906的培養(yǎng)和克隆化 惡性瘧原蟲野生株FCYN0906采集于中緬邊境的拉咱市，液氮冷凍并用干冰保存運至實驗室。按照標準的野生株復蘇和培養(yǎng)方法，建立該蟲株的體外連續(xù)培養(yǎng)。采用瘧原蟲有限稀釋法，對該蟲株進行克隆化：將原蟲懸液稀釋至每200微升0.01-0.5個原蟲至96孔板，經(jīng)過14至28天的培養(yǎng)，，共獲得了6個瘧原蟲克隆，分別定名為FCYN0906-4A、FCYN0906-4C、FCYN0906-4H、FCYN0906-5H、FCYN0906-6G和FCYN0906-6E。為確定這些克隆的基因型，我們利用本實驗室先期建立的惡性瘧原蟲微衛(wèi)星多態(tài)性分析的技術平臺，選擇8個代表性的微衛(wèi)星位點，即ARA2、TA1、TA60、TA81、TA87、TA109、PfPK2和Poly，采用半巢式PCR的方法，對6個克隆品系的基因組進行擴增,并利用Genscan方法檢測各微衛(wèi)星片段的長度。結果顯示，克隆FCYN0906-4C、4H、5H和6G在這8個位點上的微衛(wèi)星長度完全一致，表明這4個克隆屬于同一基因型的克隆品系。而克隆FCYN0906-4A和6E，其微衛(wèi)星長度在一些位點上與其他4個克隆不一致，提示其具有不同的基因型。因此本研究選用了惡性瘧原蟲野生株克隆FCYN0906-4C、4H、5H和6G進行后續(xù)研究。 2.惡性瘧原蟲野生株克隆FCYN0906-5H的全基因組測序和var基因序列的組裝 基于上述微衛(wèi)星檢測結果顯示4個瘧原蟲克隆具有相同的基因型，我們選用其中的FCYN0906-5H做Solexa全基因組測序。大量制備基因組DNA,并且通過檢測18SrRNA排除宿主DNA的污染。全基因組測序共獲得10,259,515對序列片段（reads），讀長為100bp。以已發(fā)布的3D7標準株基因組為參考序列，采用Bowtie2軟件進行序列比對。結果顯示，93.15%的序列能比對到3D7基因組上，平均基因組覆蓋率達90倍。然而，由于不同惡性瘧原蟲之間var基因序列變異度很大，特別是var基因序列高變區(qū)，因此，能覆蓋每條染色體上var基因可變區(qū)域序列的豐度很低，而覆蓋var基因相對保守區(qū)域序列豐度較高。為解決該難題，我們采用VelVet軟件對該野生型克隆的基因組數(shù)據(jù)進行了重新組裝，選取了8281個長度大于500bp的序列重疊群（contigs），圍繞DBL結構域進行var基因序列的拼接。 首先，我們從NCBI數(shù)據(jù)庫下載了所有的PfEMP1蛋白序列并建庫，用8281個contigs與之做Blastx比對，共找到217個和PfEMP1相關的contigs，采用VarDom1.0Service預測結構域，包括N末端區(qū)（NTS）、Duffy樣結合區(qū)（DBL）、富含半胱氨酸樣區(qū)（CIDR）、酸性末端區(qū)（ATS）,結果找到DBL相關的contigs66個，其中47個包含了DBL最常見的相對保守蛋白序列DIGDI及PQYLR；對于另外19個contigs，我們根據(jù)其各自的DBL高變區(qū)序列設計一條引物，結合該結構域的上游通用引物（DBL AF）及下游通用引物（DBL BR），利用PCR擴增和測序，獲得19個DBL相關序列并與之前47個contigs拼接。最終，利用這66個contigs一共拼接出50個含有完整DBL結構域的序列。如前所述，根據(jù)var基因上游序列，可將var基因家族分為不同的亞類，對此，我們提取這50個contigs的上游序列進行亞類預測，并利用根據(jù)3D7株序列設計的upsA類、upsB類和upsC類var基因通用上游引物，PCR擴增出部分數(shù)據(jù)缺失的上游序列進行測序后加以驗證。結果顯示，這50個contigs中，有36個含有上游序列可以進行分類預測，另外14個未獲得上游序列，但是其中2個DBL序列（var84，var4）具有明顯的upsA類特征，據(jù)此我們將50個contigs歸類為：11個upsA類、18個upsB類、7個upsC類、1個upsD類和1個upsE類，剩下12個的分類未知。這50個contigs能夠代表克隆FCYN0906-5H的var基因家族，其理由是：（1）已完成基因組測序的3D7標準株、HB3株及IT4株，其所有var基因一般均含有一個DBL結構域，而我們拼接的50個var基因也都含有DBL結構域，且進化樹中能夠與其他的DBL（-）區(qū)分開；（2）這50個var基因中，有42個含有NTS結構域，另外4個也含有var基因5端常見的DBL-CIDR結構。 3.惡性瘧原蟲野生株各var基因特異引物的設計和擴增效率分析 為研究惡性瘧原蟲野生株FCYN0906各個克隆的var基因轉變規(guī)律，我們需要分別設計針對50個var基因的特異性引物用于熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，檢測每個var基因的轉錄水平。對此，我們根據(jù)克隆FCYN0906-5H的50個var基因DBL高變區(qū)序列設計了相應的特異性引物。為驗證各引物的擴增效率和特異性，我們將克隆FCYN0906-5H的基因組DNA連續(xù)10倍稀釋后，檢測引物的擴增效率，結果顯示，這50對引物擴增效率為98%-100%，并且溶解曲線峰單一。由于上述微衛(wèi)星結果顯示FCYN0906-4C、4H、5H和6G的基因型一致，我們用這50對引物對4個克隆的基因組進行PCR擴增和測序，結果顯示所有引物在FCYN0906-4C、4H和6G中均能有效擴增，序列分析結果顯示這4個克隆var基因序列完全一致，這些結果進一步證實FCYN0906-4C、4H、5H和6G這4個克隆基因型的一致性。 4. FCYN0906各個克隆var基因排他性表達分析 基于惡性瘧原蟲3D7標準株的研究認為，var基因家族具有排他性表達規(guī)律，即每個瘧原蟲在其單個紅內期周期內，只有一個var基因能獲得優(yōu)勢轉錄和表達，我們一般稱這個獲得表達的成員為優(yōu)勢var基因。這種表達模式的一個合理解釋是：保護惡性瘧原蟲最主要的表面抗原庫（PfEMP1家族），避免其由于被宿主免疫系統(tǒng)完全識別而快速耗竭，這可能也是惡性瘧原蟲能夠在人體內建立長期慢性感染的細胞學基礎。由于缺乏完整的var基因家族序列，對野生型蟲株var基因的研究還停留在利用基于DBL保守區(qū)的通用引物進行PCR－克�。瓬y序以及頻率分析，從而間接獲得野生株中各個var基因的相對轉錄水平，因此在惡性瘧原蟲野生型蟲株中var基因是否同樣為排他性表達還未能加以證實。而本課題利用針對惡性瘧原蟲克隆FCYN0906-5H的50個var基因分別設計定量分析引物，對該野生株的var基因家族轉錄水平進行系統(tǒng)的定量分析。我們將凍存的克隆FCYN0906-4C、4H、5H和6G復蘇后，進行嚴格的同步化處理，并收集環(huán)狀體期的總RNA（10-15h），去除基因組DNA污染后進行逆轉錄反應，獲得cDNA后，用50對var基因特異性引物分別檢測其轉錄水平。在復蘇后20天檢測，發(fā)現(xiàn)這4個克隆分別具有不同的優(yōu)勢var基因，其中4C株優(yōu)勢轉錄var167，占所有var基因轉錄水平的61%；4H株優(yōu)勢轉錄var15，占所有var基因轉錄水平的69%；5H株優(yōu)勢轉錄var51，占所有var基因轉錄水平的44%；6G株優(yōu)勢轉錄var47，占所有var基因轉錄水平的57%。在這4個克隆中，轉錄水平居于第二位的var基因僅占總轉錄水平的5%-13%。在3D7標準株中檢測到的優(yōu)勢var基因所占百分比為40%-80%，由此可見，惡性瘧原蟲野生型克隆中的var基因家族也具有排他性表達的規(guī)律。 5. FCYN0906各個克隆在體外培養(yǎng)過程中var基因轉錄變化規(guī)律的系統(tǒng)分析 迄今為止，關于var基因家族的研究大多集中在其轉錄調控的分子機制上，但仍有少數(shù)研究對實驗室蟲株的var基因轉錄變化規(guī)律進行分析，結果顯示，var基因的轉變并非是隨機的，而是具有高度的有序性和保守性。var基因家族的排他性表達及高度有序的更替是惡性瘧原蟲表面抗原克隆變異現(xiàn)象的重要分子基礎。然而，對于var基因轉錄變化規(guī)律的研究，主要也是在3D7標準株中進行的，而野生型蟲株的var基因家族序列信息不全，難以特異性地檢測每個var基因的轉錄水平。鑒于野生型蟲株與實驗室長期培養(yǎng)蟲株的顯著差異，很有必要在野生型蟲株中對該科學問題開展系統(tǒng)的分析。在本課題中，我們組裝了野生型克隆FCYN0906-5H的50個var基因，并且設計了各自特異性的引物，從而可以對野生株var基因轉錄變化規(guī)律開展進一步的研究。于是我們將上述的4個野生型克隆培養(yǎng)物各自分成2個分瓶后進行平行實驗，每間隔10代檢測一次var基因轉錄譜的變化情況，共檢測了5個時間點；同時，我們又對這4個克隆做了第二次完全獨立的重復實驗，保證實驗過程及檢測時間點與上一次實驗一致。結果發(fā)現(xiàn)，起始優(yōu)勢var基因不同的4個克隆具有不同的var基因轉錄變化途徑，表明起始優(yōu)勢var基因會影響接下來轉錄的var基因類型，如克隆4C起始優(yōu)勢轉錄的為var167，接下來得到優(yōu)勢轉錄的有var98，var143，var21，var45；而在克隆6G中起始優(yōu)勢轉錄的為var47，則接下來得到優(yōu)勢轉錄的為var136，var163，var21。令人感興趣的是，同一克隆的4個不同分瓶之間，var基因的轉錄變化方向也不盡相同，表明野生型蟲株中var基因的轉變具有一定的隨機性，如克隆4C的兩個分瓶4C-C及4C-D在起始優(yōu)勢轉錄的var167逐漸下調后，都有var98，var21，var143的上調，但是分瓶4C-C選擇優(yōu)勢轉錄var143，而分瓶4C-D則選擇優(yōu)勢轉錄var21。同時我們發(fā)現(xiàn)，與實驗室標準株不同，野生型蟲株中單個var基因的轉錄上調或下調速率并不是固定的，如var98在分瓶4C-B中上調的速率高，能達到每代2.7%，而在分瓶4C-D中上調速率每代約0.3%，這種上調或者下調速率的可變性，同樣造成了不同分瓶之間var基因變化方向的多樣性。但是從整體上分析，這些來自于同一個野生株的克隆及其分瓶在var基因轉錄變化過程中，仍然具有一定的保守性，如克隆6G的分瓶6G-C及6G-D，都經(jīng)歷了var47的下調，var21，var136，var170的上調，最后都選擇優(yōu)勢轉錄var163，其var基因轉變的途徑相當一致；var21不僅在多個克隆中成為最終的優(yōu)勢轉錄基因，而且在4個克隆var基因的各條轉變路線中都起了重要的過渡作用，可能代表了野生株FCYN0906的一個偏好var基因。 因此，我們認為，野生型蟲株var基因家族的轉錄變化規(guī)律包含了兩個層面：有序保守性及隨機性。同時，起始優(yōu)勢var基因的類型、不同野生株偏好的var基因類型以及不同var基因成員的轉錄上調或下調速率特征影響了var基因的轉變方向。 此外，惡性瘧原蟲野生株在體外培養(yǎng)過程中，雖然大部分upsA類var基因的轉錄水平都很低，但偶爾還是有個別upsA類var基因的上調及優(yōu)勢轉錄，在無選擇壓力條件下，上調可能是隨機的，不具有重復性。 小結：本研究分離了我國云南邊境地區(qū)一株惡性瘧原蟲野生株并建立了體外培養(yǎng)。通過單克隆的方法獲得了該蟲株的克隆品系。通過對其中一個克隆全基因組測序，拼接了其50個var基因，并根據(jù)上游序列將這些var基因分類。根據(jù)var基因高變區(qū)序列，設計了50對特異性引物，采用realtimePCR方法定量分析了該野生蟲株4個克隆在體外培養(yǎng)過程中var基因轉錄類型及其轉變規(guī)律，結果顯示該野生蟲株var基因仍為排他性表達，且4個克隆及同一克隆不同分瓶之間，var基因轉變方向各不相同。本研究首次從單個var基因水平上系統(tǒng)分析了惡性瘧原蟲野生株中var基因的轉錄水平及其轉變規(guī)律，首次提出了野生株中var基因轉錄上調與下調速率的可變性，并且根據(jù)我們的結果，提出var基因轉變過程是隨機性及保守性相結合的，而以往從實驗室蟲株中得出的關于var基因轉變方向隨機性或者保守性的結論都是片面的。根據(jù)已有的文獻資料，結合本課題對惡性瘧原蟲野生株的研究結果，我們總結出惡性瘧原蟲var基因轉錄及轉變規(guī)律如下：1)野生型克隆中var基因為排他性表達；2) var基因上調與下調的速率具有可變性，即優(yōu)勢var基因可繼續(xù)保持優(yōu)勢轉錄，或迅速下調、緩慢下調，并被另一個優(yōu)勢轉錄的var基因取代；3)起始優(yōu)勢轉錄的var基因類型可影響接下來上調的var基因類型，且存在一定偏好性；4)起始優(yōu)勢的var基因在繼續(xù)優(yōu)勢轉錄或者逐漸下調的過程中，其他var基因遵循一定的變化方向；5)起始優(yōu)勢的var基因下調后，有不同的var基因上調，接下來會隨機選擇其中一個var基因優(yōu)勢轉錄；6)大部分upsA類var基因處于沉默狀態(tài)，但是會出現(xiàn)個別upsA類var基因上調及優(yōu)勢轉錄。本研究結果為闡明惡性瘧原蟲重要致病基因的轉錄調控機制提供了堅實的實驗基礎和新的研究方向。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R531.3

【共引文獻】

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1 胡東偉;丁帥;胡守鋒;孫新;;應用巢式PCR對惡性瘧原蟲培養(yǎng)中支原體污染的檢測[J];中國病原生物學雜志;2012年01期

2 杜金玲;王丹娜;石磊;呂超超;王吉瑋;孟姍姍;劉長輝;盧會英;趙亞榮;;生物制品中支原體污染及清除方法的研究進展[J];中國獸藥雜志;2012年02期

本文編號：1738052