本文選題：丙型肝炎　切入點(diǎn)：HCV　出處：《昆明理工大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)為單股正鏈RNA病毒,屬黃病毒科,丙型肝炎病毒屬。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界約有1.85億人感染HCV,75%-85%的感染者會(huì)發(fā)展為慢性肝炎,近30%的慢性感染者最終會(huì)發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。HCV主要經(jīng)由血液傳播,包括輸血傳播,靜脈吸毒,性接觸與無(wú)保護(hù)分娩等。由于多數(shù)丙肝患者無(wú)明顯的臨床癥狀,大部分患者在出現(xiàn)臨床癥狀再就醫(yī)時(shí)已經(jīng)發(fā)展為肝硬化甚至肝癌,致使人類生命健康受到嚴(yán)重威脅。 丙型肝炎的臨床常用治療藥物為干擾素/利巴韋林聯(lián)合療法,其治療有效率及病程進(jìn)展很大程度上取決于感染病毒的基因型。其中,干擾素對(duì)1型和4型HCV感染的治療效果差,而基因3型HCV感染與脂肪病變和纖維化高度有關(guān)。盡管最近以依賴RNA的RNA聚合酶(RdRp)為靶點(diǎn)的抗病毒藥物sofosbuvir(也稱PSI-7977)的使用,較大程度提高了患者持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答率,由于病毒在此區(qū)段固然發(fā)生的基因變異,仍可導(dǎo)致耐藥發(fā)生,亟待開發(fā)新型抗病毒藥物。 黃酮類化合物的抗病毒活性已被廣泛報(bào)道。本研究為驗(yàn)證該類化合物對(duì)HCV的抑制效果,在J6/JFH1-Huh7.5.1HCV細(xì)胞培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上,以WST法檢測(cè)化合物對(duì)Huh7.5.1細(xì)胞的細(xì)胞毒性,Real time RT-PCR法檢測(cè)化合物對(duì)HCV的抑制作用,將得到的選擇指數(shù)SI值(IC50/EC50)與陽(yáng)性對(duì)照藥物RBV比較,從而判斷化合物的抗病毒效果。其中,陽(yáng)性對(duì)照藥物聚乙二醇IFN-α2b無(wú)明顯細(xì)胞毒性,半數(shù)有效濃度(EC50)約為0.354IU/mL。利巴韋林半數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制濃度(IC50)為21.04μg/mL,半數(shù)有效濃度(EC50)為2.19μg/mL,選擇指數(shù)(SI)為9.6。在此藥物篩選體系基礎(chǔ)上對(duì)50種化合物進(jìn)行了抗HCV活性初篩,得到23種抗HCV有效化合物,27種抑制效果不明顯化合物。 間接免疫熒光法通過(guò)檢測(cè)化合物不同濃度處理組core蛋白的表達(dá)水平(熒光的表達(dá))做為HCV RNA檢測(cè)的替代指標(biāo),并以此為指標(biāo)評(píng)價(jià)化合物抗病毒效果。正交試驗(yàn)得出實(shí)驗(yàn)用最佳細(xì)胞密度為1×104個(gè)細(xì)胞/孔,病毒最適感染復(fù)數(shù)為1。通過(guò)觀察熒光的表達(dá)來(lái)檢測(cè)6種初篩有效化合物對(duì)HCV的抑制作用,其中陽(yáng)性對(duì)照藥物干擾素在1-100IU/mL的范圍內(nèi)可以有效抑制病毒的產(chǎn)生,只有在0.1IU/mL才觀察到60%左右的熒光。利巴韋林在100-1000μg/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì)HCV抑制率達(dá)90%,半數(shù)抑制濃度在1-10μg/mL之間。6種初篩有效化合物中,黃酮類衍生物58153a,58158a和6518在其最大濃度可以有效抑制HCV,但因其細(xì)胞毒性較大,無(wú)法反應(yīng)化合物對(duì)病毒的抑制效果。其它濃度的細(xì)胞對(duì)照組均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性,并隨著化合物濃度的降低,熒光數(shù)逐漸增加。FMR-04的細(xì)胞毒性和抗病毒效果呈劑量依賴趨勢(shì),最低濃度的抑制率高50%。WDC-14和WDC-17細(xì)胞毒性較小,在最高濃度對(duì)HCV的抑制達(dá)90%以上,與病毒對(duì)照組比較,兩種化合物在最低濃度均未觀察到50%以上的熒光。 通過(guò)測(cè)定6種初篩有效化合物無(wú)明顯細(xì)胞毒性濃度抑制后的病毒上清的感染滴度,進(jìn)一步驗(yàn)證6種化合物對(duì)HCV的抑制作用。不加藥組的病毒滴度為7×105.25PFU/mL,陽(yáng)性對(duì)照藥物干擾素(10IU/mL)處理后病毒滴度為7×101.77PFU/mL,遠(yuǎn)小于病毒對(duì)照組。黃酮類衍生物58153a(10μg/mL)和58158a(7.5μg/mL)作用后的病毒滴度非常相近,分別為7×104.5PFU/mL和7×104.4PFU/mLWDC系列的WDC-14和WDC-17化合物在20μg/mL的濃度對(duì)病毒抑制后的感染滴度均為7×10367PFU/mL。FMR系列的FMR-04(20μg/mL)作用后的病毒滴度為7×1045PFU/mL。黃酮類衍生物6518(10μg/mL)對(duì)病毒的抑制效果最好,經(jīng)其抑制后病毒感染滴度為7×103.5PFU/mL。 用Macsynergy Ⅱ軟件的三維劑量效應(yīng)表面分析4種有效化合物與干擾素聯(lián)合使用的抗病毒效果。化合物6518高濃度時(shí),表現(xiàn)出一定的協(xié)同效應(yīng),但總體表現(xiàn)為拮抗作用。化合物58153a和FMR-04表現(xiàn)出明顯的拮抗作用,WDC-14總體表現(xiàn)為協(xié)同作用。 采用三種不同加藥方式初步探索化合物有效作用時(shí)段�；衔�58153a主要作用于病毒吸附于宿主細(xì)胞前的過(guò)程或與病毒復(fù)制相關(guān)的宿主因子,6518主要作用于病毒吸附后的過(guò)程如病毒翻譯、復(fù)制等相關(guān)環(huán)節(jié),FMR-04主要作用于病毒吸附后的早期階段如病毒脫衣殼、翻譯、復(fù)制等相關(guān)環(huán)節(jié),而WDC-14主要作用于病毒吸附后的后期階段的病毒翻譯、復(fù)制等相關(guān)環(huán)節(jié)。 本研究對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行了一系列的篩選,最終獲得的4種有效抗病毒化合物可為抗HCV的黃酮類化合物的新藥設(shè)計(jì)和研發(fā)及臨床用藥提供重要參考。
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【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R512.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1730401