本文選題：殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體　切入點(diǎn)：HLA-C　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：第一章KIR及其配體HLA-C基因多態(tài)性與肺結(jié)核的關(guān)聯(lián)研究 [研究背景] 結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的具有傳染性的疾病之一。2012年WHO發(fā)布的全球結(jié)核病報(bào)告指出,2011年全球約有870萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病例,有140萬(wàn)人死于結(jié)核病。我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一,根據(jù)第五次全國(guó)結(jié)核流行病調(diào)查報(bào)告顯示,如果不采取有效的控制措施,未來(lái)的10年我國(guó)可能有近5000萬(wàn)的人感染結(jié)核病菌。結(jié)核病屬于慢性細(xì)胞內(nèi)感染,主要通過表達(dá)于免疫細(xì)胞表面的受體與結(jié)核桿菌的識(shí)別介導(dǎo)天然和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,進(jìn)而激活抗原提呈等反應(yīng),控制結(jié)核菌的感染。因此,結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸與機(jī)體的免疫系統(tǒng)的變化密切相關(guān),參與結(jié)核免疫應(yīng)答的任一環(huán)節(jié)發(fā)生變化,可能就會(huì)影響到個(gè)體的免疫應(yīng)答水平,從而影響個(gè)體對(duì)疾病的易感性以至于影響疾病的發(fā)生發(fā)展。 殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)是NK細(xì)胞和某些效應(yīng)T細(xì)胞表面表達(dá)的可以特異性識(shí)別人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA) I類分子的受體,具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。目前,KIR基因家族由8個(gè)與抑制功能有關(guān)的基因(2DLI,2DL2,2DL3,2DL4,2DL5,3DL1,3DL2和3DL3)、6個(gè)與活化功能有關(guān)的基因(2DS1,2DS2,2DS3,2DS4,2DS5和3DS1)、2個(gè)假基因(3DP1x和3DP1v)及1D組成。KIR蛋白結(jié)構(gòu)包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū),胞外區(qū)有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域,可以與其配體HLA-I類分子結(jié)合,它的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)決定了KIR受體傳導(dǎo)的是激活信號(hào)還是抑制信號(hào)。KIR基因座位編碼在常染色體19q13.4,具有高度的多樣性,表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)和功能的多樣性：①不同的個(gè)體攜帶不同的KIR基因數(shù)目及種類；②等位基因多樣性；③基因型的多樣性；④單倍型(haplotype)的高度多樣性。迄今為止,人類白細(xì)胞抗原系統(tǒng)是最具多態(tài)性的系統(tǒng),是染色體上的一群緊密連鎖的基因群,位于6p21.3,可分為HLA-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類基因,其中,HLA-A、B、C為經(jīng)典的HLA-I類基因。HLA-C屬于經(jīng)典的HLA-I類基因,根據(jù)HLA-C分子第77、80位氨基酸的不同可分為HLA-C1組(HLA-Cw01、Cw03、Cw07、Cw08及其他相關(guān)分子)和HLA-C2組(HLA-Cw02、Cw04、Cw05、Cw06和其他相關(guān)分子)。KIR可特異性地識(shí)別表達(dá)于靶細(xì)胞表面的HLA-I類分子,形成受體-配體復(fù)合物,通過傳導(dǎo)抑制或活化性信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的活性。 KIR參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、血管炎、Ⅰ型糖尿病和丙型肝炎等。隨著KIR基因及配體在免疫應(yīng)答中的作用研究,KIR基因及配體與感染性疾病遺傳易感性的關(guān)系引起了人們極大的關(guān)注。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,墨西哥人結(jié)核病KIR2DL3基因頻率明顯高于正常人,但是,KIR基因與肺結(jié)核的關(guān)聯(lián)性在中國(guó)尚未見報(bào)道,我們推測(cè),KIR基因可能與中國(guó)漢族人肺結(jié)核的遺傳易感性有關(guān),因此我們做了以下的研究。 第一節(jié)KIR基因多態(tài)性分析 [目的] 通過研究KIR基因在肺結(jié)核患者及正常對(duì)照中的多態(tài)性,探討KIR基因多態(tài)性與肺結(jié)核的遺傳易感性是否存在關(guān)聯(lián),以期明確其介導(dǎo)的免疫遺傳因素在肺結(jié)核發(fā)病中的作用。 [方法] 1.研究對(duì)象：研究分析的400例樣本包括200例肺結(jié)核患者和200例健康對(duì)照人群。病例組來(lái)自2010年至2012年間在山東省立醫(yī)院和山東省胸科醫(yī)院收治的臨床確診的肺結(jié)核漢族住院患者,健康對(duì)照來(lái)自山東省立醫(yī)院和山東省胸科醫(yī)院查體無(wú)血緣關(guān)系的隨機(jī)健康漢族個(gè)體。所有的患者和健康對(duì)照人群在采集標(biāo)本前均被告知并簽署知情同意書,研究方案取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。 2.基因組DNA的提�。核谢颊吆徒】祵�(duì)照外周靜脈采血3ml,EDT抗凝,按照操作說(shuō)明采用外周血DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取,-20℃保存?zhèn)溆谩?3.KIR基因分型：用序列特異性引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法對(duì)所有樣本進(jìn)行KIR基因分型,KIR基因位點(diǎn)檢測(cè)6個(gè)抑制性基因(2DLI,2DL2,2DL3,2DL5,3DL1,3DL3)、6個(gè)活化性基因(2DS1,2DS2,2DS3,2DS4,2DS5,3DS1)、2個(gè)假基因(3DP1x和3DP1v)及1D。引物根據(jù)KIR的基因序列及文獻(xiàn)設(shè)計(jì)。應(yīng)用GeneAmp9700擴(kuò)增儀進(jìn)行產(chǎn)物的擴(kuò)增。 4.電泳和成像：擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠圖像分析儀進(jìn)行電泳圖象的分析,以便對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行KIR基因分型分析。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS16.0軟件對(duì)各組KIR基因表現(xiàn)頻率、基因頻率、基因型頻率和單倍型頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,篩選結(jié)核病的易感候選基因,明確與結(jié)核病不同臨床感染狀態(tài)相關(guān)的KIR易感基因。 [結(jié)果] 1.肺結(jié)核患者組KIR2DS1、KIR2DS3、KIR3DS1基因的陽(yáng)性率較對(duì)照組增高,且具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001,P0.001和P0.001)。 2.選擇性分析79例菌陰患者和30例菌陽(yáng)患者中所有被測(cè)的KIR基因,發(fā)現(xiàn)與菌陽(yáng)患者組相比,KIR2DS4和KIR2DS5在菌陰患者組的頻率較高且具有顯著性差異(P0.001和P=0.001)；與對(duì)照組比較,菌陰組KIR2DS1、2DL3和2DS4陽(yáng)性率增高(P=0.013,P=0.000和P0.001)；與對(duì)照組相比,菌陽(yáng)組KIR2DS3的陽(yáng)性率增高(P=0.011)。 3.患者攜帶兩個(gè)及以上活化KIR的頻率較對(duì)照組明顯升高(P0.001)。 4.按照常用的分型標(biāo)準(zhǔn),基因型A/B在患者中的頻率比對(duì)照組增高(P0.001),而A/A的頻率降低(P0.001),B/B在二者中的頻率無(wú)明顯差異(P=0.226);按照Hsu的命名及判定標(biāo)準(zhǔn),對(duì)照組中最常見的基因型是AJ；菌陰組FZ14出現(xiàn)的頻率最高；菌陽(yáng)組FZ1出現(xiàn)的頻率最高。 5.單倍型A在對(duì)照組中的頻率增高,而單倍型B在患者組中的頻率增高,但是二者差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)論] 1. KIR2DS1、KIR2DS3、KIR3DS1可能為結(jié)核病的易感基因,肺結(jié)核患者相對(duì)于健康對(duì)照有不同的基因型、單倍型表現(xiàn)。 2.機(jī)體免疫狀態(tài)是決定結(jié)核桿菌感染預(yù)后和轉(zhuǎn)歸的主要因素。 3.不適當(dāng)?shù)幕罨?抑制性KIR基因比例可能是導(dǎo)致機(jī)體免疫平衡紊亂的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。 第二節(jié)HLA-C基因多態(tài)性分析 [目的] 通過研究人類白細(xì)胞抗原HLA-Cw在肺結(jié)核患者及正常對(duì)照人群中的多態(tài)性,探討HLA-Cw多態(tài)性與肺結(jié)核的遺傳易感性是否存在關(guān)聯(lián),為肺結(jié)核的病因分析和臨床治療提供理論依據(jù)。 [方法] 1.研究對(duì)象：所有病例的診斷及確診同第一節(jié)。 2.所有患者和健康對(duì)照外周靜脈采血3ml,EDTA抗凝,按照操作說(shuō)明采用外周血DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取,-20℃保存?zhèn)溆谩?3.KIR基因分型：參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物,采用SSP-PCR反應(yīng)進(jìn)行基因擴(kuò)增。HLA-Cw基因檢測(cè)8個(gè)位點(diǎn),HLA-Cw*01.HLA-Cw*02.HLA-Cw*03.HLA-Cw*04. HLA-Cw*05.HLA-Cw*06.HLA-Cw*07.HLA-Cw*08.應(yīng)用GeneAmp9700擴(kuò)增儀進(jìn)行產(chǎn)物的擴(kuò)增。 4.電泳和成像：擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠圖像分析儀進(jìn)行電泳圖象的分析。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,表型頻率通過直接計(jì)數(shù)陽(yáng)性等位基因確定。 [結(jié)果] 1.HLA-Cw*08基因頻率肺結(jié)核組顯著高于對(duì)照組(P0.001)；其他基因在兩組的頻率沒有顯著性差異。 2.菌陽(yáng)組HLA-Cw*04的頻率高于菌陰組(P=0.025),而HLA-Cw*08的頻率顯著低于菌陰組(P=0.004)。 [結(jié)論] HLA-Cw基因多態(tài)性與肺結(jié)核有一定的關(guān)聯(lián)性,HLA-Cw*08可能是肺結(jié)核的易感基因,HLA-Cw*04和HLA-Cw*08等位基因可能與結(jié)核分枝桿菌的感染狀態(tài)有關(guān)。 第三節(jié)KIR基因和HLA-C與肺結(jié)核的關(guān)聯(lián)性分析 [目的] 通過研究KIR基因及其HLA-Cw配體基因在肺結(jié)核患者及正常對(duì)照人群中的多態(tài)性,探討KIR受體及其HLA-Cw配體介導(dǎo)的免疫遺傳因素在肺結(jié)核發(fā)病中的作用。 [方法] 1.研究資料同前。 2.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：KIR與HLA-C的關(guān)聯(lián)研究按照陽(yáng)性基因數(shù)/研究組總?cè)藬?shù)計(jì)算,患者組與對(duì)照組組間顯著性差異分析用SPSS16.0軟件包四格表卡方檢驗(yàn)或Fisher確切檢驗(yàn)。 [結(jié)果] 1. KIR2DL2/3及配體HLA-C1基因組合在患者組出現(xiàn)的頻率高于對(duì)照組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2. HLA-C2配體缺失時(shí)2DS1在患者中的頻率顯著升高。 3.'no KIR2DS3and no Cw*08'基因組合在患者組的頻率低于對(duì)照組,而基因組合'KIR2DS3and Cw*08'在患者組的頻率高于對(duì)照組。 4.基因組合'Cw*04and no KIR2DS1'在患者組出現(xiàn)的頻率低于對(duì)照組。 [結(jié)論] KIR基因與其配體HLA-Cw的相互作用可能參與了結(jié)核病的免疫反應(yīng)過程。 第二章肺結(jié)核患者KIR基因的表達(dá)研究 [研究背景] 目前,國(guó)內(nèi)外很多研究者已篩選出了與人結(jié)核病相關(guān)的多個(gè)候選易感基因,并且在不同國(guó)家、地區(qū)、種族間進(jìn)行了不同的探索研究,還包括了在分子水平上了解宿主遺傳學(xué)因素對(duì)其發(fā)病病程的影響。KIR基因的表達(dá)和調(diào)控主要發(fā)生于轉(zhuǎn)錄水平,可能與轉(zhuǎn)錄區(qū)的甲基化有關(guān)聯(lián)性。研究KIR的基因型,對(duì)研究疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制可能是不夠的,還需要在更深的層面上去研究作為遺傳易感因子的KIR基因在疾病中發(fā)揮的作用。 Pander.R等研究者在Nature雜志上發(fā)表聲明,將KIR分子按白細(xì)胞分化抗原(CD)分為CD158a、CD158bl、CD158b2、CD158d。CD158信號(hào)系統(tǒng)在免疫反應(yīng)中發(fā)揮怎樣的功能目前還不是太清楚。國(guó)內(nèi)缺乏對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能等與肺結(jié)核相關(guān)的研究報(bào)道,隨著人類對(duì)結(jié)核病相關(guān)免疫研究的不斷深入,免疫應(yīng)答相關(guān)基因在mRNA及蛋白水平的表達(dá)越來(lái)越受到重視。 因此,本章研究以山東漢族人群為對(duì)象,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析肺結(jié)核患者、健康對(duì)照人群外周血淋巴細(xì)胞的KIR基因mRNA的表達(dá)情況,初步對(duì)CD158分子在肺結(jié)核患者外周血表達(dá)的特點(diǎn)進(jìn)行分析,以期研究結(jié)核患者、健康對(duì)照者KIR基因在外周血的表達(dá)情況,從而為預(yù)防治療的進(jìn)一步提高,提供理論和分子學(xué)的依據(jù)。 第一節(jié)肺結(jié)核患者KIR受體mRNA在外周血的表達(dá)研究[目的] 本節(jié)研究以山東漢族人群為對(duì)象,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析肺結(jié)核患者、健康對(duì)照人群外周血淋巴細(xì)胞KIR在mRNA水平的表達(dá)情況。 [方法] 1.研究對(duì)象：研究分析的60例樣本包括30例肺結(jié)核患者和30例健康對(duì)照人群。病例組來(lái)自2012年至2013年間在山東省立醫(yī)院和山東省胸科醫(yī)院收治的臨床確診的肺結(jié)核住院漢族患者,健康對(duì)照來(lái)自山東省立醫(yī)院和山東省胸科醫(yī)院查體無(wú)血緣關(guān)系的隨機(jī)健康漢族個(gè)體。所有病例的診斷及確診同第一章第一節(jié)。 2.抽提總RNA及鑒定：所有患者和健康對(duì)照外周靜脈采血5ml, EDTA抗凝,采用Ficoll密度離心法進(jìn)行分離外周血淋巴細(xì)胞,按照RNAiso試劑盒進(jìn)行RNA的抽提。測(cè)定抽提的RNA在波長(zhǎng)260nm和280nm的紫外吸收值及RNA的濃度。 3. RT-PCR反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：每個(gè)PCR反應(yīng)體系為20ul,以框架基因β-actin mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物為內(nèi)參照,在內(nèi)參均有擴(kuò)增的條件下判定KIR基因KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、3DL1表達(dá)的情況。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳以評(píng)價(jià)是否合成了符合要求的產(chǎn)物。 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：按照說(shuō)明書使用SYBR Premix Ex TagTM試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、去除基因組DNA、Real-time PCR反應(yīng)。每個(gè)PCR反應(yīng)體系為20ul,擴(kuò)增之后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳以評(píng)價(jià)是否合成了符合要求的產(chǎn)物。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,若資料符合正態(tài)分布,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)來(lái)表示；若不符合正態(tài)分布,則以中位數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(median±S)來(lái)表示。 [結(jié)果] 1.對(duì)肺結(jié)核患者和健康對(duì)照人群KIR的基因分型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),有些個(gè)體KIR基因表現(xiàn)型頻率與其表達(dá)率不相符,這可能是由于不同基因的mRNA水平有一定差異造成的。 2.通過RT-PCR,患者KIR2DL3表達(dá)率較正常對(duì)照組升高(56.67%vs.30%,P=0.037),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR,肺結(jié)核患者KIR2DL3在mRNA水平的表達(dá)顯著升高(1.17±0.38vs.0.94±0.25,P0.01),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)論] 肺結(jié)核患者抑制性KIR2DL3的表達(dá)可能受外周血淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)影響；KIR基因型與表型的不相符可能會(huì)使其所表達(dá)KIR基因水平有很大的差異。 第二節(jié)肺結(jié)核患者外周血CD158a和CD158b表達(dá)的研究 [目的] 本節(jié)研究以山東漢族人群為對(duì)象,應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分析肺結(jié)核患者、健康對(duì)照人群外周血CD158的表達(dá)情況。 [方法] 1.研究對(duì)象：同第二章第一節(jié)。 2.流式檢測(cè)CD158a和CD158b的表達(dá)情況：10μl抗人CD3抗體,10μl抗人CD16/56抗體,10μl抗人CD158a抗體,10μl抗人CD158b抗體對(duì)PBMCs染色,同時(shí)標(biāo)記同型對(duì)照。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。差異對(duì)比分析前要先行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),采用單因素方差分析和t檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1.肺結(jié)核患者組CD3-CD16/56+的NK細(xì)胞上CD158a的表達(dá)率與正常對(duì)照人群相似,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.CD158b的數(shù)量明顯低于對(duì)照組,差別有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(7.97±2.63%vs.9.58±2.92%, P=0.022)。 [結(jié)論] CD158b所介導(dǎo)的抑制信號(hào)有可能會(huì)影響肺結(jié)核疾病的進(jìn)展。 第三章肺結(jié)核合并乙肝患者KIR基因的研究 [研究背景] 根據(jù)目前的流行病學(xué)調(diào)查,我國(guó)的肺結(jié)核發(fā)病率呈現(xiàn)出了上升趨勢(shì),同時(shí)也是一個(gè)乙肝大國(guó),全國(guó)大約有一億兩千萬(wàn)人表現(xiàn)乙肝表面抗原陽(yáng)性。目前尚未有確切的全國(guó)合并乙型肝炎病毒(HBV)感染的結(jié)核病患者的人數(shù)統(tǒng)計(jì),但我國(guó)有大量的文獻(xiàn)和研究結(jié)果表明,肺結(jié)核合并HBV病毒感染可以嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,從而給家庭和社會(huì)帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)。 通過研究KIR的基因多態(tài)性和肺結(jié)核合并HBV感染之間是否存在關(guān)聯(lián),以尋找肺結(jié)核合并HBV感染的易感性候選基因,從而探討免疫遺傳因素在其發(fā)病中的作用。其次,本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析CD3, GD16/CD56,CD158f在肺結(jié)核合并乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)情況,探討肺結(jié)核合并乙肝感染者KIR的表達(dá)特征。最后,臨床上,將CD56+CD3-的細(xì)胞認(rèn)定為NK細(xì)胞。NK細(xì)胞的毒性殺傷實(shí)驗(yàn)?zāi)茌^好的展示NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷作用的影響,探討新鮮分離的NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性,以及其殺傷活性是否和KIR有關(guān)。 第一節(jié)肺結(jié)核合并乙肝患者KIR基因多態(tài)性研究 [目的] 通過研究KIR的基因多態(tài)性和肺結(jié)核合并HBV感染之間是否存在關(guān)聯(lián),以尋找肺結(jié)核合并HBV感染的易感性候選基因,從而探討免疫遺傳因素在其發(fā)病中的作用。 [方法] 1.研究對(duì)象：選擇2011年至2013年間在山東省立醫(yī)院和山東省胸科醫(yī)院收治的40例肺結(jié)核合并乙肝病毒感染患者和100例正常對(duì)照人群。 2.易感性KIR基因篩選：應(yīng)用PCR-SSP技術(shù)進(jìn)行KIR基因分型分析。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：同第一章第一節(jié)。 [結(jié)果] KIR基因2DL5、2DS1、3DS1在肺結(jié)核合并乙肝患者中的頻率增高,且差異有顯著性意義。KIR2DL5:70%vs.50%, P=0.031;2DS1:65%vs.26%, P0.001;2DS3:67.5%vs.48%,P=0.037. [結(jié)論] KIR2DL5、2DS1和3DS1在患者中的頻率高于健康對(duì)照組,提示這些KIR基因可能與MTB與HBV混合感染的易感性有關(guān),并有可能會(huì)影響病情的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。 第二節(jié)肺結(jié)核合并乙肝患者外周血NK細(xì)胞CD158f的表達(dá) [目的] 本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析CD3,CD16/CD56,CD158f在肺結(jié)核合并乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)情況,探討肺結(jié)核合并乙肝感染者KIR的表達(dá)特征；探討結(jié)核合并乙肝患者新鮮分離的NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性,以及其殺傷活性是否和KIR有關(guān)。 [方法] 1.研究對(duì)象：根據(jù)前一節(jié)的研究結(jié)果,篩選出了不同KIR基因型及表型的患者和健康對(duì)照,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行了登記,為的是獲得不同KIR表型的患者和健康對(duì)照的外周血PBMC/NK細(xì)胞。易感性KIR基因篩選：應(yīng)用PCR-SSP技術(shù)進(jìn)行KIR基因分型分析。 2.外周血單個(gè)核細(xì)胞CD158f的檢測(cè)：首先分離外周血PBMC,10μl抗人CD3抗體,10μl抗人CD16/56抗體,10μ1抗人CD158航體對(duì)PBMCs染色,同時(shí)設(shè)同型對(duì)照。 3.NK細(xì)胞殺傷功能檢測(cè)：根據(jù)基因分型結(jié)果,抽取研究個(gè)體15mL抗凝靜脈血,分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,采用免疫磁珠方法分選NK細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其純度。用LDH殺傷試劑盒K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行NK細(xì)胞殺傷功能檢測(cè),根據(jù)OD值計(jì)算NK細(xì)胞殺傷活性。 [結(jié)果] 1.肺結(jié)核合并乙肝患者組CD3-CD16/56+的NK細(xì)胞上CD158f的表達(dá)率比正常對(duì)照人群高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(12.18±2.58%vs.6.76±2.11%,P0.001). 2.NK細(xì)胞殺傷活性在兩組(CD158+和CD158-)中有差別,可能與HLA Ⅰ類分子表達(dá)無(wú)關(guān),因?yàn)镵562細(xì)胞表面不表達(dá)HLA Ⅰ類分子。 3.外周血NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞具有一定的殺傷作用。不同效靶比殺傷活性不同。 [結(jié)論] 1.肺結(jié)核合并乙肝患者外周血CD158f的表達(dá)率比正常對(duì)照人群高。 2.肺結(jié)核合并HBV患者外周血NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞有一定的殺傷作用,不同個(gè)體對(duì)靶細(xì)胞不同效靶比之間NK細(xì)胞的殺傷活性有顯著性差異：NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)與其KIR的基因型、表型均有一定的相關(guān)性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R521;R446.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1725352