本文選題：新型隱球菌　切入點(diǎn)：單核細(xì)胞　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：研究背景和目的隱球菌病是一類嚴(yán)重威脅人們生命安全的疾病。由新型隱球菌引起的腦部感染可引起腦膜及腦實(shí)質(zhì)的炎癥,常表現(xiàn)為腦膜腦炎。隱球菌孢子通常通過呼吸道吸入而引起感染,接著定植到肺組織,肺內(nèi)有大量的肺泡巨噬細(xì)胞可以清除外來侵襲物,然而還有一些未被清除的隱球菌孢子潛伏了下來,隱球菌可通過在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外大量增殖的方式導(dǎo)致肺部的感染,亦或散布到其他器官。它可以潛伏在吞噬細(xì)胞,通過“特洛伊木馬”形式繞過血腦屏障,最終引起隱球菌性腦膜腦炎,然而新型隱球菌為何傾向定植于腦部的機(jī)制尚未闡明。在隱球菌感染早期階段宿主即可產(chǎn)生干擾素,這是宿主免疫防御的第一道防線。在臨床研究中,我們發(fā)現(xiàn)隱球菌病患者血清中IFN-α和IFN-γ顯著降低,接著通過查閱文獻(xiàn)及生物信息學(xué)分析,提示miR-155可能在抗隱球菌免疫反應(yīng)的IFN分泌中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。有研究表明,在T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中,某些特定的抗原及IFN-γ等可以誘導(dǎo)miR-155表達(dá)；miR-155基因敲除小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的免疫功能缺陷,包括B細(xì)胞、T細(xì)胞及抗原提呈細(xì)胞的功能異常；然而關(guān)于miR-155在新型隱球菌刺激后引起單核細(xì)胞調(diào)節(jié)干擾素的機(jī)制還未被深入研究。因此,本研究擬研究單核細(xì)胞抗隱球菌免疫應(yīng)答中"miR-155-IRF2BP2-干擾素”軸的分子調(diào)控機(jī)制。為尋找免疫調(diào)節(jié)治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法1、采用ELISA分析隱球菌病患者血清干擾素水平,密度梯度離心法分離正常人、隱球菌病患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞,磁珠分選分離出單核細(xì)胞,Trizol法抽提RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測miRNA的表達(dá)水平。2、采用Real-time PCR的方法驗(yàn)證芯片檢測的結(jié)果,檢測單核細(xì)胞系U937接受熱滅活隱球菌刺激后干擾素的表達(dá)；采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),將miRNA-155 mimics和miRNA-155 inhibitor轉(zhuǎn)染入單核細(xì)胞系U937中,并用Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染前后miRNA-155和干擾素表達(dá)變化情況。3、通過權(quán)威預(yù)測軟件TargetScan、PicTar和miRBase取三者交集預(yù)測miR-155的可能靶點(diǎn),然后通過雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)、Real-time PCR和Western blot方法來驗(yàn)證miR-155的靶點(diǎn)。4、采用siRNA方法沉默IRF2BP2的表達(dá),后用Real-time PCR檢測沉默效率及IRF2BP2沉默后IFN-α和IFN-γ的表達(dá)變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、與健康對(duì)照組比較,隱球菌病患者血清IFN-α和IFN-γ水平顯著下降,而miR-155在單核細(xì)胞中的表達(dá)升高。2、熱滅活新型隱球菌刺激后,單核細(xì)胞系U937表達(dá)干擾素能力升高,采用"gain-and loss-of-function"的研究手段,發(fā)現(xiàn)miR-155可以負(fù)向調(diào)控IFN-α和IFN-γ的產(chǎn)生。3、使用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)、Real-time PCR和western blot方法驗(yàn)證了miR-155與IRF2BP2的3'UTR具有靶向關(guān)系。4、采用siRNA沉默了IRF2BP2的表達(dá)后,接受熱滅活新型隱球菌刺激后的單核細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-α和IFN-γ的能力下降。結(jié)論miR-155在隱球菌病患者單核細(xì)胞中表達(dá)量顯著升高,IRF2BP2是miR-155的靶點(diǎn)之一。在單核細(xì)胞中,miR-155通過IRF2BP2負(fù)向調(diào)控IFN-α和IFN-γ產(chǎn)生,進(jìn)而抑制單核細(xì)胞抗隱球菌反應(yīng),從而導(dǎo)致隱球菌感染致病,因此,miR-155可能是免疫治療隱球菌病的潛在治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:Cryptococcus is a kind of disease threatening the life and safety of people . The brain infection caused by Cryptococcus neoformans can cause the inflammation of the meninges and the brain , which is often manifested as meningoencephalitis .
The miR - 155 knockout mice had severe immune deficiency , including B cells , T cells and antigen presenting cells .
However , the mechanism of the expression of miR - 155 - IRF2BP2 - interferon in the immune response of Cryptococcus was studied by ELISA .
The expression of IFN - 偽 and IFN - 緯 was detected by means of two - luciferase reporter gene technique , Real - time PCR and Western blot . Conclusion miR - 155 can regulate the expression of IFN - 偽 and IFN - 緯 by means of double luciferase reporter gene technique , Real - time PCR and Western blot .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R519.4

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1723293