本文選題：H7N9亞型流感病毒　切入點：野鳥　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2014年博士論文

【摘要】：2013年2月19日，在我國首次發(fā)生H7N9亞型流感病毒感染人事件，并呈不斷散發(fā)態(tài)勢發(fā)展。在2014年1至2月，有110余人感染H7N9，26人死亡，家禽特別是活禽市場中的雞、鴨等是主要傳染來源。野鳥特別是候鳥（水禽類）是流感病毒的天然存儲庫得到公認，家禽中的H7N9亞型流感病毒，分析認為是由于飼養(yǎng)禽中的其它亞型流感病毒與野鳥中攜帶的流感病毒基因重組而成。但由于候鳥遷徙路線多，范圍廣，地理條件復雜，監(jiān)測人員少等原因，使得對候鳥流感病毒病原生態(tài)學調查處在初級階段，有的地方還是監(jiān)測盲區(qū)。開展流感病毒病原生態(tài)學調查，對完善流感病毒的監(jiān)測數(shù)據(jù)，了解流感病毒分布及流感病毒制劑的研發(fā)具有重要意義。同時，針對流感病毒急需研制一種新的治療制劑�？贵w是有效的緊急預防治療制劑，但流感病毒基因易發(fā)生突變重組，單一抗體不能應對新的亞型流感病毒，研究一種通用型流感病毒治療制劑是一個需要解決的技術問題。 本研究開展了2項實驗，H7N9亞型流感病毒病原生態(tài)學調查和通用型人源化抗體的初步探索。 1．H7N9亞型流感病毒病原生態(tài)學調查研究。收集全國5�。ńK、安徽、江西、湖南、吉林）16個地區(qū)野鳥與部分家禽新鮮糞便及組織等樣品2081份，進行病毒分離和亞型鑒定，并通過系統(tǒng)進化樹分析分離的H7N9亞型流感病毒與之前發(fā)現(xiàn)的H7N9的進化關系。同時進行了馴養(yǎng)綠頭鴨的人工感染實驗，檢驗H7N9亞型流感病毒是否能夠在綠頭鴨中復制。 實驗內容：（1）病毒分離。在我國5個省市16個地區(qū)進行候鳥（以水禽為主）和部分家禽樣本采集，用9日齡雞胚分離H7N9亞型流感病毒。（2）病毒亞型檢測。用RT-PCR分型引物和血凝活性實驗方法進行檢測，對鑒定為H7N9亞型的流感病毒進行基因測序，并構建系統(tǒng)進化樹。（3）H7N9亞型流感病毒受體檢測。用唾液酸受體（人樣流感病毒受體SAα2-6Gal受體，禽樣流感病毒SAα2-3Gal受體）糖鏈包被ELISA聚苯乙烯反應板，用蔗糖梯度法濃縮流感病毒，加到包被物中，再用雞抗H7N9亞型流感病毒作為一抗，HRP標記的羊抗雞二抗顯色，觀察顯色結果，應用酶標儀選擇吸光度值為492時讀值。（4）H7N9亞型流感病毒人工感染馴養(yǎng)的綠頭鴨實驗。用A/Shanghai/2/2013H7N9亞型流感病毒株，經(jīng)鼻腔感染綠頭鴨，通過病毒滴定判定復制情況。 2.流感病毒通用型人源化抗體的初步探索。篩選能與流感病毒HA根莖部保守區(qū)特異結合的抗體序列，應用計算機軟件分析抗體的結構功能及與HA結合功能區(qū)氨基酸特點，進行合成抗流病毒抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因，通過轉化、酶切、連接等分子生物學方法，將輕、重鏈可變區(qū)基因與含人抗體Fc片段的桿狀病毒表達載體PAC-κ-CH3連接，經(jīng)鑒定正確后轉染至昆蟲細胞(sf9細胞)，無血清培養(yǎng)后進行鑒定。 實驗內容、方法：（1）通過文獻檢索、蛋白質序列數(shù)據(jù)庫（Swissprot）、蛋白質結構數(shù)據(jù)庫（PBD）等獲得抗流感抗體的序列信息，經(jīng)計算機分析軟件InsightⅡ對抗體結構分析，經(jīng)過分子模擬、分子對接等方法，對抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因結構等分析，用昆蟲細胞偏嗜密碼子優(yōu)化氨基酸序列，合成抗流感病毒抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。（2）重組表達載體的構建。將合成氨基酸序列中的輕、重鏈可變區(qū)基因酶切鑒定，把輕鏈可變區(qū)基因與桿狀病毒表達載體PAC-κ-CH3連接，構建PAC-κ-L-CH3,經(jīng)鑒定正確，酶切合成的重鏈可變區(qū)基因，與PAC-κ-L-CH3連接,構建PAC-κ-L-H-CH3重組表達載體，鑒定正確后，同桿狀病毒DNA共轉染至昆蟲細胞(sf9)中，27℃，經(jīng)無血清培養(yǎng)后，收集上清。（3）人源化抗體通用性的鑒定。應用本室保存的各亞型流感病毒株，滅活后進行血凝抑制、ELISA實驗，檢測制備的抗體對流感病毒的通用性，通過熒光抗體實驗，檢測抗體在細胞中的表達情況。 通過以上實驗獲得以下結果： 1．采集的野鳥樣糞便樣品中，未分離到H7N9亞型流感病毒，但在血清及鳥蛋的卵黃中檢測到H7亞型陽性抗體；在吉林省長春市凈月家禽糞便樣品中，應用RT-PCR和SPF雞胚檢測和分離到2株H7N9流感病毒； 2．對分離的H7N9亞型流感病毒測HA和NA序列全長，應用NCBI網(wǎng)站上BLAST進行核苷酸比對，應用MAGE6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，分離到的H7N9亞型流感病毒HA與廣州2013年雞的樣本中分離的病毒株核苷酸序列在同一進化分枝，同源性為98.6%；NA與2013年福建環(huán)境樣本中分離的H7N9核苷酸序列在同一進化分枝，同源性為99.2%；經(jīng)受體檢測，分離到的H7N9亞型流感病毒可識別SAα2-3Gal和SAα2-6Gal唾液酸受體，與SAα2-3Gal結合能力強于SAα2-6Gal唾液酸受體； 3．人工感染綠頭鴨實驗中，同組及對照組綠頭鴨均未見有發(fā)病癥狀，應用雞胚對樣本進行病毒分離，未檢測到病毒復制，說明應用的流感病毒株（A/Shanghai/2/2013，H7N9）不能在綠頭鴨體內復制和傳播。 4．通過文獻檢索、蛋白質序列數(shù)據(jù)庫（Swissprot）、蛋白質結構數(shù)據(jù)庫（PBD）等獲得抗流感抗體的序列信息，經(jīng)計算機分析軟件InsightⅡ對抗體結構分析，經(jīng)過分子模擬、分子對接等方法，篩選出6組抗流感病毒抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，編號分別為A66，H40，H98，F(xiàn)10，JAN，D80。通過分子對接方法搭建了F10與HA作用的復合物結構； 5．轉染重組表達載體轉染至sf9細胞獲得桿狀病毒，，并可傳代培養(yǎng)；用血凝抑制實驗、ELISA實驗獲得3株具有通用性的抗流感病毒抗體，分別為編號H40，H98和A66，2株對2種流感病毒抑制作用，其中1株(F10)對H7N9有血凝抑制作用；1株（D80）對流感病毒沒有血凝抑制作用；熒光抗體檢測傳代細胞上清中有陽性表達。 通過以上結果得出以下結論： 1．野鳥樣品中未檢測到H7N9亞型流感病毒，野鳥傳播引發(fā)人間病例的可能性小，但是，在鷺鳥卵黃和血清中檢測到H亞型抗體，說明野鳥傳播H7亞型病毒的可能性存在；在家禽樣品中獲得2株H7N9.亞型流感病毒；用A/Shanghai/2/2013(H7N9)毒株在綠頭鴨進行人工感染實驗，結果說明該病毒在綠頭鴨體內不能復制； 2．獲得了3個對流感病毒具有抑制作用的人源化抗體，但不能抑制所有流感病毒亞型，說明在應用抗體治療流感病毒時，多種單克隆抗體混合使用會取得抑制多種亞型流感病毒的效果。 本研究結果表明H7N9亞型流感病毒病原生態(tài)學調查結果，野鳥中傳播此次感染人的H7N9亞型病毒可能性較小，在人工感染綠頭鴨H7N9亞型流感病毒的實驗中得到證實。但在血清及鳥蛋的卵黃中檢測到H7亞型流感病毒陽性抗體，這也說明野鳥中傳播H7亞型的病毒可能性存在。在進行H7N9亞型流感病原學調查前，本實驗進行流感病毒人源化通用抗體的初步探索，后期補充了H7N9病毒的實驗。在實驗中挑選出能夠對3種流感病毒具有抑制作用的抗體，但是不能抑制流感病毒的所有亞型，說明在應用抗體治療疾病時，多種單抗混合使用是一個可行性的方案，本研究同時為研制人源化抗體提供了一個技術參考和思路。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R511.7

【參考文獻】

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1 沈倍奮;;治療性抗體的改造[J];醫(yī)學分子生物學雜志;2006年04期

2 王輝;王琰;沈倍奮;;抗體庫技術中輔助噬菌體的研究進展[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2008年02期

3 SHI JianZhong;DENG GuoHua;LIU PeiHong;ZHOU JinPing;GUAN LiZheng;LI WenHui;LI XuYong;GUO Jing;WANG GuoJun;FAN Jun;WANG JinLiang;LI YuanYuan;JIANG YongPing;LIU LiLing;TIAN GuoBin;LI ChengJun;CHEN HuaLan;;Isolation and characterization of H7N9 viruses from live poultry markets--Implication of the source of current H7N9 infection in humans[J];Chinese Science Bulletin;2013年16期

4 沈倍奮;;抗體藥物研發(fā)概況[J];河南大學學報(醫(yī)學版);2012年04期

5 LI Jun;YU XinFen;PU XiaoYing;XIE Li;SUN YongXiang;XIAO HaiXia;WANG FenJuan;DIN Hua;WU Ying;LIU Di;ZHAO GuoQiu;LIU Jun;PAN JingCao;;Environmental connections of novel avian-origin H7N9 influenza virus infection and virus adaptation to the human[J];Science China(Life Sciences);2013年06期

6 高玉偉;夏咸柱;侯小強;鞠會艷;王承宇;王鐵成;黃耕;鄒嘯環(huán);;虎源流感病毒HA基因的系統(tǒng)發(fā)生分析及其在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達[J];獸類學報;2006年02期

7 王業(yè)榮;童德文;李立;劉文明;王業(yè)炳;;人源化抗體制備及其應用研究進展[J];生物技術通訊;2007年04期

8 ;Development and Evaluation of a MAb-Based ELISA for Detection of Chlamy- dophila pneumoniae Infection with Variable Domain 2 and 3 of the Major Outer Membrane protein[J];Biomedical and Environmental Sciences;2012年06期

9 何維英;高榮梅;李興瓊;蔣建東;李玉環(huán);;10種中成藥體外抗流感病毒活性研究[J];藥學學報;2010年03期

10 張毅;康京麗;王靜靜;劉愛玲;于麗萍;李金花;王幼明;;H7N9亞型流感病毒病原學及流行病學分析[J];中國動物檢疫;2013年09期

本文編號：1722785