本文選題：H7N9亞型流感病毒　切入點(diǎn)：野鳥　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2014年博士論文

【摘要】：2013年2月19日，在我國(guó)首次發(fā)生H7N9亞型流感病毒感染人事件，并呈不斷散發(fā)態(tài)勢(shì)發(fā)展。在2014年1至2月，有110余人感染H7N9，26人死亡，家禽特別是活禽市場(chǎng)中的雞、鴨等是主要傳染來(lái)源。野鳥特別是候鳥（水禽類）是流感病毒的天然存儲(chǔ)庫(kù)得到公認(rèn)，家禽中的H7N9亞型流感病毒，分析認(rèn)為是由于飼養(yǎng)禽中的其它亞型流感病毒與野鳥中攜帶的流感病毒基因重組而成。但由于候鳥遷徙路線多，范圍廣，地理?xiàng)l件復(fù)雜，監(jiān)測(cè)人員少等原因，使得對(duì)候鳥流感病毒病原生態(tài)學(xué)調(diào)查處在初級(jí)階段，有的地方還是監(jiān)測(cè)盲區(qū)。開(kāi)展流感病毒病原生態(tài)學(xué)調(diào)查，對(duì)完善流感病毒的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，了解流感病毒分布及流感病毒制劑的研發(fā)具有重要意義。同時(shí)，針對(duì)流感病毒急需研制一種新的治療制劑�？贵w是有效的緊急預(yù)防治療制劑，但流感病毒基因易發(fā)生突變重組，單一抗體不能應(yīng)對(duì)新的亞型流感病毒，研究一種通用型流感病毒治療制劑是一個(gè)需要解決的技術(shù)問(wèn)題。 本研究開(kāi)展了2項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，H7N9亞型流感病毒病原生態(tài)學(xué)調(diào)查和通用型人源化抗體的初步探索。 1．H7N9亞型流感病毒病原生態(tài)學(xué)調(diào)查研究。收集全國(guó)5�。ńK、安徽、江西、湖南、吉林）16個(gè)地區(qū)野鳥與部分家禽新鮮糞便及組織等樣品2081份，進(jìn)行病毒分離和亞型鑒定，并通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析分離的H7N9亞型流感病毒與之前發(fā)現(xiàn)的H7N9的進(jìn)化關(guān)系。同時(shí)進(jìn)行了馴養(yǎng)綠頭鴨的人工感染實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)H7N9亞型流感病毒是否能夠在綠頭鴨中復(fù)制。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：（1）病毒分離。在我國(guó)5個(gè)省市16個(gè)地區(qū)進(jìn)行候鳥（以水禽為主）和部分家禽樣本采集，用9日齡雞胚分離H7N9亞型流感病毒。（2）病毒亞型檢測(cè)。用RT-PCR分型引物和血凝活性實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)鑒定為H7N9亞型的流感病毒進(jìn)行基因測(cè)序，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。（3）H7N9亞型流感病毒受體檢測(cè)。用唾液酸受體（人樣流感病毒受體SAα2-6Gal受體，禽樣流感病毒SAα2-3Gal受體）糖鏈包被ELISA聚苯乙烯反應(yīng)板，用蔗糖梯度法濃縮流感病毒，加到包被物中，再用雞抗H7N9亞型流感病毒作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗雞二抗顯色，觀察顯色結(jié)果，應(yīng)用酶標(biāo)儀選擇吸光度值為492時(shí)讀值。（4）H7N9亞型流感病毒人工感染馴養(yǎng)的綠頭鴨實(shí)驗(yàn)。用A/Shanghai/2/2013H7N9亞型流感病毒株，經(jīng)鼻腔感染綠頭鴨，通過(guò)病毒滴定判定復(fù)制情況。 2.流感病毒通用型人源化抗體的初步探索。篩選能與流感病毒HA根莖部保守區(qū)特異結(jié)合的抗體序列，應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件分析抗體的結(jié)構(gòu)功能及與HA結(jié)合功能區(qū)氨基酸特點(diǎn)，進(jìn)行合成抗流病毒抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因，通過(guò)轉(zhuǎn)化、酶切、連接等分子生物學(xué)方法，將輕、重鏈可變區(qū)基因與含人抗體Fc片段的桿狀病毒表達(dá)載體PAC-κ-CH3連接，經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)染至昆蟲細(xì)胞(sf9細(xì)胞)，無(wú)血清培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、方法：（1）通過(guò)文獻(xiàn)檢索、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（Swissprot）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（PBD）等獲得抗流感抗體的序列信息，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析軟件InsightⅡ?qū)贵w結(jié)構(gòu)分析，經(jīng)過(guò)分子模擬、分子對(duì)接等方法，對(duì)抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因結(jié)構(gòu)等分析，用昆蟲細(xì)胞偏嗜密碼子優(yōu)化氨基酸序列，合成抗流感病毒抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。（2）重組表達(dá)載體的構(gòu)建。將合成氨基酸序列中的輕、重鏈可變區(qū)基因酶切鑒定，把輕鏈可變區(qū)基因與桿狀病毒表達(dá)載體PAC-κ-CH3連接，構(gòu)建PAC-κ-L-CH3,經(jīng)鑒定正確，酶切合成的重鏈可變區(qū)基因，與PAC-κ-L-CH3連接,構(gòu)建PAC-κ-L-H-CH3重組表達(dá)載體，鑒定正確后，同桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染至昆蟲細(xì)胞(sf9)中，27℃，經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)后，收集上清。（3）人源化抗體通用性的鑒定。應(yīng)用本室保存的各亞型流感病毒株，滅活后進(jìn)行血凝抑制、ELISA實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)制備的抗體對(duì)流感病毒的通用性，通過(guò)熒光抗體實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)抗體在細(xì)胞中的表達(dá)情況。 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)獲得以下結(jié)果： 1．采集的野鳥樣糞便樣品中，未分離到H7N9亞型流感病毒，但在血清及鳥蛋的卵黃中檢測(cè)到H7亞型陽(yáng)性抗體；在吉林省長(zhǎng)春市凈月家禽糞便樣品中，應(yīng)用RT-PCR和SPF雞胚檢測(cè)和分離到2株H7N9流感病毒； 2．對(duì)分離的H7N9亞型流感病毒測(cè)HA和NA序列全長(zhǎng)，應(yīng)用NCBI網(wǎng)站上BLAST進(jìn)行核苷酸比對(duì)，應(yīng)用MAGE6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分離到的H7N9亞型流感病毒HA與廣州2013年雞的樣本中分離的病毒株核苷酸序列在同一進(jìn)化分枝，同源性為98.6%；NA與2013年福建環(huán)境樣本中分離的H7N9核苷酸序列在同一進(jìn)化分枝，同源性為99.2%；經(jīng)受體檢測(cè)，分離到的H7N9亞型流感病毒可識(shí)別SAα2-3Gal和SAα2-6Gal唾液酸受體，與SAα2-3Gal結(jié)合能力強(qiáng)于SAα2-6Gal唾液酸受體； 3．人工感染綠頭鴨實(shí)驗(yàn)中，同組及對(duì)照組綠頭鴨均未見(jiàn)有發(fā)病癥狀，應(yīng)用雞胚對(duì)樣本進(jìn)行病毒分離，未檢測(cè)到病毒復(fù)制，說(shuō)明應(yīng)用的流感病毒株（A/Shanghai/2/2013，H7N9）不能在綠頭鴨體內(nèi)復(fù)制和傳播。 4．通過(guò)文獻(xiàn)檢索、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（Swissprot）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（PBD）等獲得抗流感抗體的序列信息，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析軟件InsightⅡ?qū)贵w結(jié)構(gòu)分析，經(jīng)過(guò)分子模擬、分子對(duì)接等方法，篩選出6組抗流感病毒抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，編號(hào)分別為A66，H40，H98，F(xiàn)10，JAN，D80。通過(guò)分子對(duì)接方法搭建了F10與HA作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu)； 5．轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至sf9細(xì)胞獲得桿狀病毒，，并可傳代培養(yǎng)；用血凝抑制實(shí)驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)獲得3株具有通用性的抗流感病毒抗體，分別為編號(hào)H40，H98和A66，2株對(duì)2種流感病毒抑制作用，其中1株(F10)對(duì)H7N9有血凝抑制作用；1株（D80）對(duì)流感病毒沒(méi)有血凝抑制作用；熒光抗體檢測(cè)傳代細(xì)胞上清中有陽(yáng)性表達(dá)。 通過(guò)以上結(jié)果得出以下結(jié)論： 1．野鳥樣品中未檢測(cè)到H7N9亞型流感病毒，野鳥傳播引發(fā)人間病例的可能性小，但是，在鷺鳥卵黃和血清中檢測(cè)到H亞型抗體，說(shuō)明野鳥傳播H7亞型病毒的可能性存在；在家禽樣品中獲得2株H7N9.亞型流感病毒；用A/Shanghai/2/2013(H7N9)毒株在綠頭鴨進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果說(shuō)明該病毒在綠頭鴨體內(nèi)不能復(fù)制； 2．獲得了3個(gè)對(duì)流感病毒具有抑制作用的人源化抗體，但不能抑制所有流感病毒亞型，說(shuō)明在應(yīng)用抗體治療流感病毒時(shí)，多種單克隆抗體混合使用會(huì)取得抑制多種亞型流感病毒的效果。 本研究結(jié)果表明H7N9亞型流感病毒病原生態(tài)學(xué)調(diào)查結(jié)果，野鳥中傳播此次感染人的H7N9亞型病毒可能性較小，在人工感染綠頭鴨H7N9亞型流感病毒的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。但在血清及鳥蛋的卵黃中檢測(cè)到H7亞型流感病毒陽(yáng)性抗體，這也說(shuō)明野鳥中傳播H7亞型的病毒可能性存在。在進(jìn)行H7N9亞型流感病原學(xué)調(diào)查前，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行流感病毒人源化通用抗體的初步探索，后期補(bǔ)充了H7N9病毒的實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中挑選出能夠?qū)?種流感病毒具有抑制作用的抗體，但是不能抑制流感病毒的所有亞型，說(shuō)明在應(yīng)用抗體治療疾病時(shí)，多種單抗混合使用是一個(gè)可行性的方案，本研究同時(shí)為研制人源化抗體提供了一個(gè)技術(shù)參考和思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R511.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1722785