本文選題：炎癥小體　切入點(diǎn)：漢灘病毒　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：漢灘病毒（hantaan virus, HTNV）是引起我國(guó)腎綜合征出血熱（hemorrhagic feverwith renal syndrome, HFRS）最主要的病原體。HFRS主要表現(xiàn)為發(fā)熱、出血、低血壓休克、腎臟衰竭和多臟器功能不全綜合征，自1955年首例發(fā)病報(bào)告以來(lái)，發(fā)病率和病死率居高不下，一直是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民生命健康的嚴(yán)重公共安全問(wèn)題。HFRS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為病毒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的直接損傷以及機(jī)體的免疫病理?yè)p害均參與了HTNV的致病過(guò)程，尤其是機(jī)體免疫系統(tǒng)中免疫復(fù)合物的形成、炎性因子的大量分泌（炎癥風(fēng)暴）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷作用在HFRS的發(fā)病機(jī)制中扮演了極其重要的角色。 炎癥小體（inflammasomes）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類位于細(xì)胞內(nèi)、可以引起炎癥細(xì)胞因子IL-1β/IL-18分泌、繼而誘發(fā)炎癥反應(yīng)的多聚蛋白復(fù)合體。炎癥小體識(shí)別的配體種類非常廣泛，涵蓋了細(xì)菌、病毒、脂肪酸、結(jié)晶結(jié)構(gòu)等，是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中重要的成份，也是機(jī)體細(xì)胞抵抗外源病原體感染和消除內(nèi)源危險(xiǎn)因子刺激的首要免疫屏障。目前研究已知，多種病毒感染靶細(xì)胞后均可以激活炎癥小體，誘發(fā)局部的炎癥反應(yīng)以及后續(xù)的免疫反應(yīng)。與此同時(shí)，病毒也使用了多種策略來(lái)逃逸炎癥小體的識(shí)別，從而使自身能夠在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖。 由于HTNV能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌IL-1β，因此，HTNV很有可能也激活了細(xì)胞內(nèi)的炎癥小體。因此，，我們檢測(cè)了HTNV感染THP-1細(xì)胞后IL-1β的分泌，以及NLRP3炎癥小體相關(guān)基因和蛋白水平的變化，同時(shí)評(píng)價(jià)了Ca2+在HTNV感染過(guò)程中的作用。結(jié)果如下： 1.我們首先構(gòu)建了HTNV-cRNA標(biāo)準(zhǔn)品，建立了熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HTNV拷貝數(shù)的方法，所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)理想，具有良好的線性關(guān)系。通過(guò)分析擴(kuò)增曲線和融解曲線，發(fā)現(xiàn)該方法具有良好的敏感性、特異性以及重復(fù)性，用其檢測(cè)THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中HTNV的病毒載量，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 2. HTNV感染THP-1細(xì)胞后，可以引起pro-IL-1β蛋白表達(dá)的增加以及IL-1β的分泌，并且pro-IL-1β蛋白表達(dá)的水平和IL-1β的分泌量與感染的病毒量呈正比。同時(shí)，IL-1β的分泌需要病毒復(fù)制和增殖過(guò)程的誘導(dǎo)，單純的病毒核酸及蛋白刺激均不能引起IL-1β分泌。 3. HTNV感染THP-1細(xì)胞后，可以引起炎癥相關(guān)基因的表達(dá)增高，特別是NLRP3炎癥小體基因的表達(dá)增高，并且NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)也增高，我們還用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)了NLRP3炎癥小體在HTNV感染THP-1細(xì)胞后的定位情況，分別從基因和蛋白水平證實(shí)了HTNV感染可以引起NLRP3炎癥小體的激活。此外，我們使用NLRP3siRNA和caspase-1抑制劑，進(jìn)一步驗(yàn)證了NLRP3炎癥小體在HTNV感染中的作用。 4.我們還檢測(cè)了活細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+在THP-1細(xì)胞中的變化情況，發(fā)現(xiàn)HTNV感染THP-1細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高，螯合細(xì)胞外Ca2+會(huì)導(dǎo)致IL-1β分泌的減少，提示Ca2+有可能參與了NLRP3炎癥小體的激活過(guò)程。 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)HTNV感染THP-1細(xì)胞可以激活NLRP3炎癥小體，增加細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+的濃度，啟動(dòng)下游caspase-1和IL-1β信號(hào)通路，最終導(dǎo)致IL-1β的分泌，誘發(fā)局部的炎癥反應(yīng)。本研究為探索HTNV感染靶細(xì)胞的具體過(guò)程和機(jī)制提供了一些新的證據(jù)和思路。
[Abstract]:Hantaan virus ( HTNV ) is one of the most important pathogens causing hemorrhagic fever with renal syndrome in China .

Inflammatory small body ( IL - 1尾 / IL - 18 ) is an important component in the innate immune system , and it is an important component in the innate immune system . It is also a primary immune barrier against exogenous pathogen infection and the elimination of endogenous risk factors .

Because HTNV can stimulate the secretion of IL - 1尾 in endothelial cells and monocytes , HTNV may also activate the inflammatory cells in cells . Therefore , we have detected the secretion of IL - 1尾 in HTNV infected THP - 1 cells , as well as changes in gene and protein levels associated with NLRP3 inflammation , and also evaluated the role of Ca2 + in HTNV infection . The results are as follows :

1 . We first constructed the HTNV - cRNA standard , established the method of detecting HTNV copy number by fluorescence real - time quantitative PCR . The obtained standard curve parameter is ideal and has a good linear relationship . By analyzing the amplification curve and the melting curve , it is found that the method has good sensitivity , specificity and repeatability , and it can be used to detect the viral load of HTNV in THP - 1 cell culture supernatant .

2 . When HTNV infected THP - 1 cells , the expression of pro - IL - 1尾protein and secretion of IL - 1尾can be induced , and the level of pro - IL - 1尾protein expression and the secretion of IL - 1尾are directly proportional to the amount of viral infection . At the same time , IL - 1尾secretion requires the induction of viral replication and proliferation , and only viral nucleic acid and protein stimulation can not induce IL - 1尾 secretion .

3 . After the infection of THP - 1 cells with HTNV , the expression of inflammation - related genes increased , especially the expression of NLRP3 - inflammatory small - body gene was increased , and the expression of NLRP3 - associated protein was increased .

4 . We also detected the changes of free Ca2 + in THP - 1 cells , and found that HTNV infected THP - 1 cells could increase intracellular Ca 2 + concentration , and Ca2 + could decrease the secretion of IL - 1尾 , suggesting that Ca2 + might participate in the activation of NLRP3 inflammatory cells .

In conclusion , we find that HTNV infected THP - 1 cells can activate NLRP3 inflammatory cells , increase intracellular free Ca2 + concentration , activate downstream caspase - 1 and IL - 1尾 signaling pathways , eventually lead to the secretion of IL - 1尾and induce local inflammatory responses . This study provides some new evidence and ideas for exploring the specific processes and mechanisms of HTNV infected target cells .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R512.8

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本文編號(hào)：1690274