本文選題：戊型肝炎病毒　切入點(diǎn)：貝類　出處：《沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是一種人畜共患性病原,因其廣泛的跨物種間傳播流行病學(xué)特征可能造成對(duì)我國(guó)食品安全與公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域的嚴(yán)重威脅。本研究利用貝類非選擇性天然富集病毒的作用特點(diǎn),通過建立分子生物學(xué)檢測(cè)手段調(diào)查HEV在近海水域中貝類體內(nèi)的污染分布情況。并結(jié)合國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)中的微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估基本理論對(duì)我國(guó)貝類中HEV感染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估建立了一套參考數(shù)據(jù)模型。評(píng)估數(shù)據(jù)可為我國(guó)食源性HEV的監(jiān)測(cè)與防控工作提供科學(xué)依據(jù)。另外,本研究還進(jìn)一步地開展了 HEV基因工程重組活載體乳酸菌的研究。上述具體研究結(jié)果如下:1.貝類中HEV的分子檢測(cè)方法的建立首先利用RNA裝甲技術(shù)制備了 HEV分子檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)控品,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了貝類中HEV分子檢測(cè)新方法的研究,包括貝類中HEV的富集與多種RT-PCR檢測(cè)方法的研究,并對(duì)其有效性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。分析結(jié)果表明:①獲得的假病毒顆�？勺鳛橥ㄓ肏EV基因1-4型RT-PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品;②改進(jìn)的貝類中HEV的富集方法病毒回收率達(dá)5-14%。③建立的針對(duì)4型HEV的nRT-PCR和RT-LAMP方法特異性高、敏感性與國(guó)際參考方法qRT-PCR相當(dāng),分別達(dá)到了 2.5×102copies 和 101 copies/μL。2.貝類中HEV的污染調(diào)查與遺傳進(jìn)化樹分析通過本研究建立的HEV nRT-PCR方法對(duì)我國(guó)環(huán)黃、渤海地區(qū)的近海水域中貝類的污染狀況進(jìn)行了調(diào)查。調(diào)查結(jié)果顯示,①近海水域中平均每公斤貝類HEV污染率達(dá)17.5%,受污染的地區(qū)有7個(gè);②經(jīng)qRT-PCR鑒定,泥蚶、紅蚶和雜色蚶三種貝類中HEV污染含量分布在6.23 × 102到6.36 ×103基因拷貝數(shù)范圍內(nèi),且統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(p0.05);③利用Mega6.0軟件將新分離鑒定的13株HEV基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,結(jié)果表明所有新分離株的基因均為HEV基因4型(G4)HEV,與人和豬源HEV親源關(guān)系相近并且可繼續(xù)劃分成G4b、G4d以及一個(gè)未知亞型群組。3.貝類中HEV風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估本研究針對(duì)貝類中HEV污染調(diào)查情況以及相關(guān)膳食調(diào)查數(shù)據(jù),利用CAC的MRA方法對(duì)該地區(qū)貝類中HEV進(jìn)行了定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)黃-渤海地區(qū)三省一市的居民每餐食用貝類引發(fā)感染HEV的平均概率為0.000300055(約百萬分之三);預(yù)計(jì)年均每百萬人感染比率約為0.4%;預(yù)計(jì)每年0-14歲、和14歲以上人口的感染數(shù)分別為49 722、755 707人,合計(jì)805 429人。本次評(píng)估由于采用了近似人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物的消化道途徑HEV的劑量反應(yīng)參數(shù),因此存在一定的不確定性。4.戊型肝炎病毒衣殼蛋白乳酸菌展示系統(tǒng)的構(gòu)建與免疫學(xué)評(píng)價(jià)① Western blotting和IFA鑒定結(jié)果表明,本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pNZ8149-inaQN-ORF2能夠?qū)⑸倭康腍EV衣殼蛋白ORF2經(jīng)INP膜錨定蛋白表達(dá)展示于宿主菌L.lactis NZ3900表面。②小鼠粘膜特異性抗體IgA的ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,口服免疫重組菌L.lactis NZ3900能夠很好地刺激小鼠消化道、呼吸道和泌尿生殖道的粘膜免疫應(yīng)答。與對(duì)照菌體組相比,特異性抗ORF2抗體IgA在消化道和呼吸道中水平可從首免后的第35天到第63天維持在較高水平而在泌尿生殖道中只能維持到首免后的第49 天(P0.05,P0.01)。③小鼠血清中特異性抗體IgG的ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,口服免疫重組菌L.lactis NZ3900能夠有效刺激小鼠產(chǎn)生針對(duì)ORF2抗原的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。與對(duì)照菌體相比,特異性抗ORF2抗體IgG滴度可高水平維持在首免后的第21天到第63天。④小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明,在首免后的第35至63天內(nèi),實(shí)驗(yàn)組脾T淋巴細(xì)胞增殖能力顯著高于對(duì)照組(p0.05,p0.01)。⑤小鼠細(xì)胞因子分泌水平的ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,在首免后的第49天,ELISA檢測(cè)免疫小鼠脾T淋巴細(xì)胞分泌IL-4水平顯著高于對(duì)照組(P0.01),而IFN-y的分泌水平在實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組之間無差異。提示針對(duì)Th2介導(dǎo)的細(xì)胞因子的上調(diào)得到加強(qiáng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.6;TS201.6

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