發(fā)布時間：2018-03-29 16:05

  本文選題：戊型肝炎病毒　切入點：貝類　出處：《沈陽農(nóng)業(yè)大學》2015年博士論文

【摘要】：戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是一種人畜共患性病原,因其廣泛的跨物種間傳播流行病學特征可能造成對我國食品安全與公共衛(wèi)生安全領域的嚴重威脅。本研究利用貝類非選擇性天然富集病毒的作用特點,通過建立分子生物學檢測手段調(diào)查HEV在近海水域中貝類體內(nèi)的污染分布情況。并結合國際食品法典委員會(CAC)中的微生物風險評估基本理論對我國貝類中HEV感染風險評估建立了一套參考數(shù)據(jù)模型。評估數(shù)據(jù)可為我國食源性HEV的監(jiān)測與防控工作提供科學依據(jù)。另外,本研究還進一步地開展了 HEV基因工程重組活載體乳酸菌的研究。上述具體研究結果如下:1.貝類中HEV的分子檢測方法的建立首先利用RNA裝甲技術制備了 HEV分子檢測陽性質(zhì)控品,并在此基礎上進行了貝類中HEV分子檢測新方法的研究,包括貝類中HEV的富集與多種RT-PCR檢測方法的研究,并對其有效性進行了系統(tǒng)分析。分析結果表明:①獲得的假病毒顆�？勺鳛橥ㄓ肏EV基因1-4型RT-PCR檢測的標準品和質(zhì)控品;②改進的貝類中HEV的富集方法病毒回收率達5-14%。③建立的針對4型HEV的nRT-PCR和RT-LAMP方法特異性高、敏感性與國際參考方法qRT-PCR相當,分別達到了 2.5×102copies 和 101 copies/μL。2.貝類中HEV的污染調(diào)查與遺傳進化樹分析通過本研究建立的HEV nRT-PCR方法對我國環(huán)黃、渤海地區(qū)的近海水域中貝類的污染狀況進行了調(diào)查。調(diào)查結果顯示,①近海水域中平均每公斤貝類HEV污染率達17.5%,受污染的地區(qū)有7個;②經(jīng)qRT-PCR鑒定,泥蚶、紅蚶和雜色蚶三種貝類中HEV污染含量分布在6.23 × 102到6.36 ×103基因拷貝數(shù)范圍內(nèi),且統(tǒng)計學差異顯著(p0.05);③利用Mega6.0軟件將新分離鑒定的13株HEV基因序列進行遺傳進化分析,結果表明所有新分離株的基因均為HEV基因4型(G4)HEV,與人和豬源HEV親源關系相近并且可繼續(xù)劃分成G4b、G4d以及一個未知亞型群組。3.貝類中HEV風險評估本研究針對貝類中HEV污染調(diào)查情況以及相關膳食調(diào)查數(shù)據(jù),利用CAC的MRA方法對該地區(qū)貝類中HEV進行了定量風險評估。結果發(fā)現(xiàn)環(huán)黃-渤海地區(qū)三省一市的居民每餐食用貝類引發(fā)感染HEV的平均概率為0.000300055(約百萬分之三);預計年均每百萬人感染比率約為0.4%;預計每年0-14歲、和14歲以上人口的感染數(shù)分別為49 722、755 707人,合計805 429人。本次評估由于采用了近似人類的靈長類動物的消化道途徑HEV的劑量反應參數(shù),因此存在一定的不確定性。4.戊型肝炎病毒衣殼蛋白乳酸菌展示系統(tǒng)的構建與免疫學評價① Western blotting和IFA鑒定結果表明,本研究設計構建的重組質(zhì)粒pNZ8149-inaQN-ORF2能夠?qū)⑸倭康腍EV衣殼蛋白ORF2經(jīng)INP膜錨定蛋白表達展示于宿主菌L.lactis NZ3900表面。②小鼠粘膜特異性抗體IgA的ELISA檢測結果表明,口服免疫重組菌L.lactis NZ3900能夠很好地刺激小鼠消化道、呼吸道和泌尿生殖道的粘膜免疫應答。與對照菌體組相比,特異性抗ORF2抗體IgA在消化道和呼吸道中水平可從首免后的第35天到第63天維持在較高水平而在泌尿生殖道中只能維持到首免后的第49 天(P0.05,P0.01)。③小鼠血清中特異性抗體IgG的ELISA檢測結果表明,口服免疫重組菌L.lactis NZ3900能夠有效刺激小鼠產(chǎn)生針對ORF2抗原的系統(tǒng)性免疫應答。與對照菌體相比,特異性抗ORF2抗體IgG滴度可高水平維持在首免后的第21天到第63天。④小鼠脾T淋巴細胞增殖的CCK-8檢測結果表明,在首免后的第35至63天內(nèi),實驗組脾T淋巴細胞增殖能力顯著高于對照組(p0.05,p0.01)。⑤小鼠細胞因子分泌水平的ELISA檢測結果表明,在首免后的第49天,ELISA檢測免疫小鼠脾T淋巴細胞分泌IL-4水平顯著高于對照組(P0.01),而IFN-y的分泌水平在實驗與對照組之間無差異。提示針對Th2介導的細胞因子的上調(diào)得到加強。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.6;TS201.6

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