發(fā)布時間：2018-03-23 22:31

  本文選題：慢性乙型肝炎　切入點(diǎn)：核苷類似物　出處：《華中科技大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：[研究背景及目的] 我國是乙肝大國,慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B, CHB)患者人數(shù)眾多,由其導(dǎo)致的終末期肝病嚴(yán)重威脅人們健康。有效的抗病毒治療可以減少肝纖維化、肝硬化、肝癌等并發(fā)癥的發(fā)生,顯著改善預(yù)后。目前乙肝抗病毒治療的藥物主要分為兩大類,一類為核苷類似物(Nucleotide Analogues, NAs),在我國使用的NAs主要有4種：拉米夫定(LAM),阿德福韋酯(ADV),替比夫定(LDT),恩替卡韋(ETV)。另一類藥物為干擾素(IFN),包括普通IFN和長效IFN (Peg-IFN). NAs和IFN作用特點(diǎn)各有不同：NAs抑制病毒復(fù)制的作用很強(qiáng),同時口服給藥,攜帶使用方便,副作用較小。缺點(diǎn)是較難獲得理想的治療終點(diǎn),即HBeAg/HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換或者HBsAg的清除,同時停藥后容易復(fù)發(fā)。另外NAs需要長時間服藥,易導(dǎo)致耐藥的風(fēng)險。IFN的治療優(yōu)勢是有限療程(一般12個月,有的可以延長到18個月),以及高的HBeAg/HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率和清除率,獲得持久的免疫學(xué)控制,停藥后復(fù)發(fā)率低。缺點(diǎn)是使用較為復(fù)雜,副作用較多,同時病毒自身可進(jìn)化并開發(fā)出各種策略抑制IFN相關(guān)信號通路的活化,導(dǎo)致IFN使用效率降低。CHB患者的優(yōu)似/個體化治療已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn),已經(jīng)有很多學(xué)者嘗試?yán)肐FN和NAs這兩類藥物各自的優(yōu)勢,采用更好的治療方案,例如聯(lián)合,序貫治療,以獲得更好的臨床治療效果。 從IFN的分子機(jī)制來說,在乙肝抗病毒治療中它是唯一同時具有抗病毒和直接免疫調(diào)節(jié)作用的藥物。體外研究表明：IFN抗病毒效應(yīng)是通過如下機(jī)制實(shí)現(xiàn)的,IFN進(jìn)入體內(nèi)后首先與細(xì)胞表面IFN受體結(jié)合,活化多種信號分子,例如STAT1(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活分子1),進(jìn)而激活經(jīng)典的JAK/STAT信號通路,誘導(dǎo)下游抗病毒效應(yīng)基因的產(chǎn)生而發(fā)揮抗病毒作用。在這些效應(yīng)基因中,以抗粘液病毒蛋白(MxA),2’,5’-寡腺苷酸合成酶(2’,5’-OAS),蛋白激酶R(PKR)等最為重要。MxA是IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的分布于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì),具有廣譜的抗病毒活性,對正黏病毒、棒狀病毒、小RNA病毒及乙肝病毒均有強(qiáng)大的抑制作用。而2’,5’-OAS可以啟動核酸水解酶,通過選擇性地降解病毒RNA來發(fā)揮抑制病毒的作用。JAK/STAT通路存在一些負(fù)性調(diào)控基因來抑制其活化,在IFN激活JAK/STAT通路的同時,這些負(fù)性調(diào)控基因也會通過負(fù)反饋被激活,來避免信號通路的過度活化。在這些負(fù)性調(diào)控因子中,以SOCS3(細(xì)胞因子信號通路抑制分子3)、PIAS (STAT1激活抑制蛋白)等最為重要。SOCS3能通過結(jié)合磷酸化的細(xì)胞因子受體,使JAKs失活,抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。相比較而言,PIAS更像緩沖劑,通過控制活化STAT的數(shù)量來調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。 在慢性乙型肝炎治療中,IFN應(yīng)答率并不高,說明IFN抵抗的情況可能出現(xiàn)在慢性乙肝患者治療中。同時IFN在治療慢性乙型肝炎過程中發(fā)揮抗病毒,免疫調(diào)節(jié)作用以及病毒抵抗IFN的分子機(jī)制尚未完全闡明。OSST臨床研究是一項在HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者中使用Peg-IFN-α和ETV聯(lián)合或序貫治療以優(yōu)化血清學(xué)轉(zhuǎn)換的研究,本文的研究對象為一部分來自O(shè)SST臨床試驗(yàn)的患者。我們將患者臨床應(yīng)答情況與IFN的信號通路研究相結(jié)合,觀察不同臨床結(jié)局患者外周血和肝組織中相關(guān)信號分子的表達(dá)情況,并進(jìn)一步比較其差異。我們的研究結(jié)果為使用NAs治療的CHB患者優(yōu)化治療策略提供了新的理論依據(jù)。同時深化了對IFN治療CHB患者相關(guān)分子機(jī)制以及病毒抵抗機(jī)制的理解,為進(jìn)一步尋找IFN治療相關(guān)預(yù)測指標(biāo)以及靶點(diǎn)提供了新的研究思路。 本研究內(nèi)容如下： 1我們將E抗原陽性慢性乙型肝炎經(jīng)治患者(使用ETV治療,并獲得持續(xù)病毒學(xué)控制的患者)隨機(jī)分為兩組,A組序貫使用IFN治療,B組繼續(xù)使用ETV治療。同時在治療過程中觀察相關(guān)臨床指標(biāo)HBV DNA、HBeAg、HBsAg、ALT的動態(tài)變化,并比較48周,96周時兩組間總應(yīng)答率(HBeAg/HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,HBsAg清除)的差異,以期望能發(fā)揮兩種藥物各自的優(yōu)勢,使患者獲得更加理想的治療終點(diǎn)。 2觀察患者PBMC和肝組織中IFN相關(guān)信號通路分子治療過程中的動態(tài)變化并比較組間(有應(yīng)答和無應(yīng)答組)差異,同時結(jié)合臨床應(yīng)答,嘗試建立兩者間的聯(lián)系。 [研究方法] 1基于上述研究背景,我們選取同濟(jì)醫(yī)院單中心的E抗原陽性慢性乙型肝炎經(jīng)治患者(這些患者屬于OSST臨床研究中的一部分)。入組標(biāo)準(zhǔn)為已使用ETV治療9-36月,HBV DNA陰性但未發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。按照隨機(jī)分組的原則將患者分到A組和B組,每組各27名患者。A組使用Peg-IFN規(guī)范治療一年(初始8周使用ETV+IFN聯(lián)合治療),治療結(jié)束后繼續(xù)隨訪一年,B組繼續(xù)使用ETV治療。治療過程中動態(tài)觀察臨床相關(guān)指標(biāo)的變化,并在48周,96周時比較兩組間總應(yīng)答率的差異。 2為了深入研究IFN信號通路以及其下游的抗病毒效應(yīng)分子和治療應(yīng)答的關(guān)系,我們收集了本中心A,B兩組各27名慢性乙型肝炎患者不同時間點(diǎn)(0、4、12、24、36、48、72、96周)的外周血標(biāo)本并分離PBMC,將PBMC分別提取RNA和蛋白。使用Real Time PCR檢測PBMC中STAT1, MxA,2',5'-OAS和SOCS3在治療過程中的動態(tài)變化情況,同時使用Western-Blot方法檢測了IFN信號通路關(guān)鍵分子磷酸化STAT1的表達(dá)。 3我們收集了部分A組患者治療前后(0,48周)肝組織標(biāo)本,采用Real Time PCR方法檢測了治療前后STAT1, MxA,2',5'-OAS以及SOCS3的表達(dá),同時用免疫組織化學(xué)(IHC)的方法檢測了肝組織中磷酸化的STAT1以及SOCS3在治療前后的表達(dá)情況,以進(jìn)一步明確IFN治療前后信號通路關(guān)鍵分子,負(fù)性調(diào)控基因與治療結(jié)局之間的聯(lián)系。 [結(jié)果] 1A,B兩組患者基線特征無差異。A組內(nèi)有應(yīng)答患者和無應(yīng)答患者基線HBsAg有顯著差異,治療過程中A組患者HBsAg的下降幅度顯著高于B組,A組內(nèi)有應(yīng)答患者HBsAg治療過程中下降幅度顯著高于無應(yīng)答患者。在48周,96周時,A組的總應(yīng)答率(HBeAg/HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,HBsAg清除)高于B組(22.2%vs3%,37%vs3%)。 2A組患者在使用IFN治療后,PBMC中STAT1, MxA,2',5'-OAS, SOCS3的mRNA水平均有增高,而使用NAs治療的B組患者PBMC中這些分子的表達(dá)沒有明顯變化。進(jìn)一步在A組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn),A組內(nèi)應(yīng)答和未獲得應(yīng)答患者PBMC中基線SOCS3的mRNA水平有顯著差異。與基線相比較,A組有應(yīng)答患者PBMC中4周時STAT1和4周,12周時MxA的mRNA增長幅度顯著高于未獲得應(yīng)答的患者。和基線相比較,4周時磷酸化STAT1蛋白水平的增長幅度在A組有應(yīng)答和無應(yīng)答患者間有顯著差異。HBsAg的下降幅度(0周-48周)分別和STAT1, MxA的mRNA增長幅度(STAT14周/0周,MxA12周/0周)正相關(guān)。 3A組患者肝組織磷酸化STAT1免疫組化染色結(jié)果顯示：未獲得應(yīng)答者基線磷酸化STAT1的表達(dá)顯著高于有應(yīng)答患者,有應(yīng)答患者48周時磷酸化的STAT1表達(dá)較基線相比明顯上調(diào),無應(yīng)答患者48周時磷酸化STAT1的表達(dá)水平未見明顯變化。和基線相比,有應(yīng)答患者48周STAT1, MxA的mRNA水平增長幅度顯著高于無應(yīng)答患者。有應(yīng)答患者48周時SOCS3的mRNA水平的上調(diào)幅度顯著低于無應(yīng)答患者,SOCS3免疫組化染色結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。 [結(jié)論] 1在NAs治療取得了持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答,但未出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換的慢性乙肝患者,轉(zhuǎn)換為序貫使用IFN治療可以有效提高此類患者的血清學(xué)轉(zhuǎn)換率,獲得理想的治療終點(diǎn)。從我們的研究結(jié)果來看,這種序貫治療方案治療效果優(yōu)于繼續(xù)單用NAs治療。 2在PBMC中的研究表明：IFN信號通路中的STAT1分子,下游抗病毒蛋白MxAmRNA水平早期的增長幅度以及SOCS3的基線水平和患者的治療結(jié)局有關(guān),STAT1和MxA的增長幅度和治療過程中HBsAg的下降程度正相關(guān),提示這些基因一定程度上可以預(yù)測IFN的療效。 3肝組織中研究表明：基線磷酸化STAT1水平較高的患者對IFN治療的應(yīng)答較差,48周時磷酸化STAT1表達(dá)水平顯著上調(diào)的患者應(yīng)答較好。治療前后(48周/0周)肝臟中STAT1, MxA, SOCS3的增長幅度和治療結(jié)局相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R512.62

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1655509