本文選題：新生隱球菌　切入點(diǎn)：HIV-1gp41　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：一、研究背景和目的 新生隱球菌(Cryptococcus neoformans,Cn)是一種具有莢膜的酵母型真菌,廣泛存在于土壤和鴿糞中,主要感染免疫力低下和免疫缺陷人群,其嗜中樞的治病特性極易引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染,尤其以HIV相關(guān)性隱球菌腦膜炎最為嚴(yán)重,死亡率極高。因此,作為AIDS最嚴(yán)重的真菌感染并發(fā)癥,新生隱球菌腦膜炎的研究已成為HIV和真菌研究的熱點(diǎn)。 新生隱球菌以呼吸道吸入為主要致病途徑,通過(guò)無(wú)癥狀的肺部感染后穿越肺泡-毛細(xì)血管屏障進(jìn)入血循環(huán)播散至其他深部組織,主要是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)主要有緊密連接的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Brain microvasclar endothelial cell, BMEC)構(gòu)成,新生隱球菌只有穿透血腦屏障才能引起腦膜炎。我們之前研究了Cn與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human BMEC)之間的相互作用,新生隱球菌可以誘導(dǎo)HBMEC產(chǎn)生細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白重排和細(xì)胞膜表面的CD44在分配。 多糖莢膜是新生隱球菌主要的毒性因子。Ambrose Jong等研究表明,新生隱球菌的CPS1基因編碼其透明質(zhì)酸酶(hyaluronic acid synthase),后者合成透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)。HA可以結(jié)合HBMEC表面的主要黏附分子CD44,與新生隱球菌黏附侵襲腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞密切相關(guān)。HA幾乎是所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的胞質(zhì)成分,還可能參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過(guò)程。目前已經(jīng)利用染色體同源重組技術(shù),構(gòu)建了新生隱球菌B4500FO2株的CPS1基因缺失株TYCC645#32和CPS1基因回補(bǔ)株CPIP,不表達(dá)HA的TYCC645#32相對(duì)于B4500FO2,對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附侵襲率明顯降低,證明HA作為CD44的配體,是粘附侵襲HBMEC的重要毒力因子。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上有多種HA的受體,如CD44, RHAMM, Ivd4,其中CD44是新生隱球菌HA的最主要受體,主要分布在細(xì)胞中的膜脂筏(lipid rafts)上,可以在細(xì)胞膜和胞質(zhì)間流動(dòng),這種流動(dòng)的膜結(jié)構(gòu)可能是其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的基礎(chǔ)。新生隱球菌感染腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞后,CD44分子再分配于膜脂筏中,由胞質(zhì)向細(xì)胞膜再聚集,經(jīng)過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白重排,使新生隱球菌進(jìn)入宿主細(xì)胞。 另外,黏附分子CD44表達(dá)于多種類(lèi)型的細(xì)胞中,涉及多種細(xì)胞的免疫過(guò)程,如細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞間的黏連和細(xì)胞遷移、生存、分化等,是一個(gè)分布廣泛的細(xì)胞表面受體家族。透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合區(qū)域和一個(gè)共同的跨膜結(jié)構(gòu)是CD44的保守區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn),新生隱球菌CPS1野生株刺激腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞CD44過(guò)度表達(dá),在結(jié)合位點(diǎn)可見(jiàn)大量的CD44。同時(shí),白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用也依賴(lài)CD44/HA。 單核吞噬系統(tǒng)是免疫反應(yīng)的第一道防線,單核吞噬細(xì)胞可以吞噬殺傷新生隱球菌,但是新生隱球菌依賴(lài)多糖莢膜等多種毒力因子可以在吞噬細(xì)胞內(nèi)生存繁殖,特別是HIV感染患者單核吞噬細(xì)胞功能失調(diào)時(shí)就成為隱球菌從血循環(huán)向深部組織擴(kuò)散的工具。目前已有多方面的證據(jù)支持存在木馬機(jī)制的穿血腦屏障模式。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,將和單核細(xì)胞共孵育的隱球菌注入小鼠后,其腦組織真菌負(fù)荷相比單純注射隱球菌明顯增多。HIV-1gp41-I90可以誘導(dǎo)HBMEC膜脂筏和CD44重新分布和高表達(dá),從而促進(jìn)新生隱球菌對(duì)HBMEC的黏附侵襲。 趨化遷移實(shí)驗(yàn)是一種研究新生隱球菌感染時(shí),單核細(xì)胞與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用和運(yùn)動(dòng)的很好的實(shí)驗(yàn)方法和手段。實(shí)驗(yàn)裝置是一種有特定孔徑的杯狀的膜濾器,將腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞鋪于膜上以模擬血腦屏障。這種實(shí)驗(yàn)手段經(jīng)常被用于共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲等多方面的研究中。 本研究目的將利用人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human brain microvasclar endothelial cell, HBMEC)構(gòu)建體外血腦屏障模型,通過(guò)黏附和趨化遷移實(shí)驗(yàn)研究新生隱球菌感染HBMEC對(duì)單核細(xì)胞的粘附和遷移通過(guò)血腦屏障的影響,HIV-1gp41-I90單獨(dú)作用以及與新生隱球菌協(xié)同刺激HBMEC對(duì)單核細(xì)胞遷移通過(guò)血腦屏障的影響；利用體外黏附和趨化遷移實(shí)驗(yàn),對(duì)比使用CD44抑制劑和抗體前后,單核細(xì)胞遷移的變化,以證明CD44是影響單核細(xì)胞遷移的關(guān)鍵分子；利用免疫熒光技術(shù),比較HIV-1gp41-I90和Cn協(xié)同作用HBMEC誘導(dǎo)細(xì)胞表面CD44表達(dá)的情況。 二、研究方法 1、單核細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)新生隱球菌、HIV-1gp41-I90感染HBMEC后的單核細(xì)胞粘附情況：實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)用HBMEC鋪96孔板106cell/孔,將實(shí)驗(yàn)用各菌株真菌以EM培養(yǎng)基稀釋為108cfu/ml備用,以下列各種條件刺激單層HBMEC:不同劑量的Gn、HIV-1gp41-I90孵育3h,以相同劑量的Cn、HIV-1gp41-190孵育不同時(shí)間,以相同菌量的不同菌株孵育3h,孵育真菌或HIV-1gp41-I90后再孵育Bikunin或抗CD44抗體,然后加入THP-1孵育1h,顯微鏡下計(jì)數(shù)黏附在HBMEC上的THP-1細(xì)胞數(shù),計(jì)算黏附率。 2、單核細(xì)胞趨化遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)新生隱球菌、HIV-1gp41-I90感染HBMEC后的單核細(xì)胞遷情況：將106cell鋪于趨化小槽(Millicell,12μm孔徑)中培養(yǎng)3-5天,測(cè)試TEER值在200-300Ω2·cm2時(shí)可以進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)。以下列各條件刺激趨化槽中的HBMEC:不同劑量的Cn、HIV-1gp41-I90孵育3h,以相同劑量的Cn、HIV-1gp41-I90孵育不同時(shí)間,以相同菌量的不同菌株孵育3h,孵育真菌或HIV-1gp41-I90后再孵育Bikunin或抗CD44抗體,然后加入THP-1孵育3h后計(jì)數(shù)遷移到下槽液中的細(xì)胞數(shù),計(jì)算出遷移率。 3、免疫熒光方法檢測(cè)新生隱球菌、HIV-1gp41-I90感染后HBMEC的CD44的表達(dá)：HBMEC培養(yǎng)在24孔板中,以不同菌量的野生株B4500F02孵育3h以觀察不同菌量感染HBMEC對(duì)CD44表達(dá)的作用；以相同菌量的B4500FO2分別孵育30min、2h和3h以觀察不同孵育時(shí)間對(duì)CD44表達(dá)的影響；以0、5×106cfu/mL的B4500FO2、 gp41-19020μg/mL和20μg/mL的gp41協(xié)同5×106cfu/mL的Cn分別孵育HBMEC3h,然后免疫熒光染色觀察CD44表達(dá)的情況。 三、結(jié)果 1、新生隱球菌感染HBMEC后對(duì)THP-1細(xì)胞的黏附和遷移作用與真菌菌量和感染時(shí)間相關(guān) 以野生株B4500F02不同劑量組(106、5×106和5×107cfu/mL)感染HBMEC誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的相對(duì)黏附率分別為136±6.7%、165±6.4%和197±9.6%,遷移率分別為28.875±2.21%、29.625±1.15%和36.55±1.95%,與對(duì)照組相比有明顯差異,P0.05；以野生株B4500F02感染HBMEC不同孵育時(shí)間組(1、2和6h)誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的相對(duì)黏附率分別為165±6.4%、221±9.8%和320±14.7%,不同孵育時(shí)間組(1、2、3、6、12和24h)對(duì)應(yīng)遷移率分別為23.42±1.39%、27.925±0.34%、29.625±1.15%、39.575±3.55%、45.055±6.11%和50.77±2.83%,與對(duì)照組相比3h組有差異,P0.05,6-24h組差異明顯,P0.01。 2、新生隱球菌感染HBMEC后對(duì)THP-1細(xì)胞的促黏附和遷移作用可被CD44阻斷劑Bikunin和抗體不同程度的阻斷 應(yīng)用不同濃度阻斷劑Bikunin(0.1nM、1nM、5nM和20nM)后相對(duì)黏附率分別為82±4%、48±3.4%、37±3.4%和30±3.9%,遷移率為21.625±1.22%、19.45±2.22%、13.675±0.64%和12.725±1.61；應(yīng)用不同濃度的anti-CD44抗體(10ng、100ng、500ng和1000ng)后相對(duì)黏附率分別為91±3.6%、77±3.3%、58±4.5%和32±3.9%,遷移率分別為21.775±1.86%、21.775±1.86%、13.875±1.99%和10.075±1.15%,各組與PBS對(duì)照組比較有明顯差異,P0.01。 3、新生隱球菌感染HBMEC后對(duì)THP-1細(xì)胞的促黏附和遷移作用與莢膜HA有關(guān) 利用HA的野生株、缺失株和回補(bǔ)株Cn分別感染內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的THP-1相對(duì)黏附率分別為165±6.3%、126±5.8%和158±6.9%,野生株相比對(duì)照組、缺失株均有顯著差別,P0.01；遷移率分別為30.575±1.99%、23.85±1.79%和26.825±1.67%,野生株相比對(duì)照組有顯著差異,P0.01,野生株相比HA缺失株差異明顯,P0.05。 4、新生隱球菌數(shù)量和感染時(shí)間影響HBMEC細(xì)胞上CD44的表達(dá) 利用熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)隨真菌濃度和孵育時(shí)間的增加,細(xì)胞膜上CD44表達(dá)增強(qiáng),且信號(hào)向細(xì)胞膜集中。不同的孵育時(shí)間對(duì)CD44的表達(dá)也有很大影響,相比對(duì)照組,孵育2h和3h組的熒光信號(hào)變得更強(qiáng),且向細(xì)胞膜集中。 5、HIV-1gp41-I90感染HBMEC后對(duì)THP-1細(xì)胞的促黏附和遷移作用與其劑量和孵育時(shí)間相關(guān) 和HBMEC一同孵育的HIV-1gp41-I90濃度的增加及孵育時(shí)間的延長(zhǎng)可以促進(jìn)THP-1黏附和遷移。HIV-1gp41-I90的四個(gè)濃度組(0.2、2、20和200μg/mL)誘導(dǎo)THP-1的相對(duì)黏附率分別是107±0.5%、117.5±9.5%、150±2.6%和235±15%,當(dāng)濃度達(dá)到2μg/mL時(shí),相比對(duì)照組相對(duì)黏附率有明顯差異,P0.05,濃度達(dá)到20-200μg/mL時(shí),相對(duì)黏附率相比對(duì)照組有顯著差異,P0.01；遷移率分別是21.575±4.47%、24.483±3.16%、29.05±3.48%和30.6±3.97%,與對(duì)照組比較,濃度在20-200μg/mL時(shí)有明顯差異,P0.05。 6、HIV-1gp41-I90可以增強(qiáng)新生隱球菌感染HBMEC后對(duì)THP-1細(xì)胞的黏附和遷移作用 以PBS、Cn、HIV-1gp41-I90和HIV-1gp41-I90+Cn的四個(gè)組分別感染HBMEC誘導(dǎo)THP-1的相對(duì)黏附率分別是100±0%、186.5±7.47%、150.7±2.8%和228.6±29.3%,各組相比對(duì)照組,相對(duì)黏附率均有顯著差異,P0.01; HIV-1gp41-I90+Cn組和單純Cn組相比,相對(duì)黏附率有顯著差異,P0.01; HIV-1gp41-I90+Cn和單純HIV-1gp41-I90組相比,相對(duì)黏附率有特別顯著的差異,P0.001。從遷移實(shí)驗(yàn)看,不論是gp41或Cn單獨(dú)作用于HBMEC,還是HIV-1gp41和Cn共同作用于HBMEC,其遷移率相對(duì)于對(duì)照組都有明顯提高(P0.01),且隨著后者相互作用的時(shí)間延長(zhǎng),遷移率亦隨著增加；根據(jù)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析的組間多重比較的結(jié)果,gp41+Cn組相比對(duì)照組和單純gp41組有明顯差異(P0.01)。 7、HIV-1gp41-I90增強(qiáng)Cn感染HBMEC誘導(dǎo)THP-1趨化遷移的作用可能與CD44分子密切相關(guān) Bikunin的4個(gè)濃度組0.1nM、1nM、5nM和20nM)抑制HIV-1gp41-I90增強(qiáng)Cn感染內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)THP-1的遷移率分別為19.21±3.71%%、15.22±2.99%、12.75±1.9%和11.725±4.84%,5nM和20nM濃度組與對(duì)照比較有顯著差異,P0.01。另外,CD44免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的CD44熒光信號(hào)在HIV-1gp41-I90+Cn組最強(qiáng)。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)和重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析進(jìn)行,方差不齊時(shí)進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換。P0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 五、結(jié)論 1、新生隱球菌體外感染腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞可以誘導(dǎo)THP-1的黏附和遷移。 2、新生隱球菌體外感染腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)THP-1黏附和遷移的作用可能與CD44分子密切相關(guān)。 3、HIV-1gp41-I90作用腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞可以誘導(dǎo)THP-1的黏附和遷移。 4、HIV-1gp41-190可以增強(qiáng)Cn感染腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)THP-1的黏附和遷移。 5、HIV-1gp41-190增強(qiáng)Cn感染腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)THP-1趨化的作用可能與CD44分子密切相關(guān)
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R519.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 龍敏;曹虹;Ambrose Jong;;HIV-1gp41胞外域?qū)π律[球菌致人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架改變的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年03期

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本文編號(hào)：1622230