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Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL17和IL22抗乙肝病毒復(fù)制的體外研究

發(fā)布時(shí)間:2018-03-12 14:28

  本文選題:乙型肝炎病毒 切入點(diǎn):白介素17 出處:《山東大學(xué)》2013年博士論文 論文類型:學(xué)位論文


【摘要】:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)屬嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae),基因組長約3.2kb,為部分雙鏈環(huán)狀DNA,可引起人的急、慢性肝炎。長期慢性乙肝病毒感染是肝纖維化,肝硬化及肝癌的高危因素。慢性乙型病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,宿主的免疫調(diào)節(jié)紊亂是導(dǎo)致病毒不能有效清除,引起慢性炎癥,病情遷延不愈的重要原因。眾多的細(xì)胞因子不僅參與了機(jī)體的免疫調(diào)節(jié),并且具有直接抑制病毒復(fù)制的作用。例如在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型中已經(jīng)證實(shí),白細(xì)胞介素(interleukin, IL)6、IL12和IL18等均具有非細(xì)胞毒性的抑制乙肝病毒復(fù)制的作用。IL12和IL2也已有應(yīng)用于慢性乙型病毒性肝炎患者的臨床病例的報(bào)道。IL17和IL22是輔助性T細(xì)胞17(T help cell17,Thl7)主要效應(yīng)細(xì)胞因子。目前很多研究證實(shí)Thl7參與到急性或慢性肝損害的炎癥反應(yīng)中。有研究表明,在慢性乙肝患者中,血清中IL17的濃度和Th17的數(shù)量與血清中HBV DNA水平呈負(fù)相關(guān);血清中HBV DNA水平與肝臟炎癥水平呈正相關(guān),而IL22水平與肝臟炎癥水平呈負(fù)相關(guān)。Th17細(xì)胞的細(xì)胞因子IL17和IL22可能具有抑制HBV復(fù)制的作用。實(shí)驗(yàn)選取了在可持續(xù)復(fù)制HBV的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15中進(jìn)行驗(yàn)證。 抗粘病毒蛋白A(MxA)和2’,5’寡腺苷酸合成酶(OAS)是兩個(gè)重要的抗病毒蛋白,其具有抗多種病毒復(fù)制的作用,包括HBV. MxA在胞漿內(nèi)與病毒的核糖核蛋白復(fù)合物直接結(jié)合,在病毒侵入細(xì)胞的早期抑制病毒復(fù)制。OAS可使ATP聚合成2,5-寡腺苷酸,以激活細(xì)胞內(nèi)核酸酶,降解病毒mRNA,從而抑制病毒蛋白合成。在本實(shí)驗(yàn)中,進(jìn)一步研究了IL17導(dǎo)致的HBV抑制作用與MxA和OAS的關(guān)系。 第一部分IL17在肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15中抑制HBV復(fù)制的研究 目的:觀察IL17在可持續(xù)分泌HBV的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15(?)中抑制HBV復(fù)制的作用。 方法:分別用不同濃度(4ng/ml、1ng/ml和250pg/ml)的IL17和anti-IL17R Ab (anti-IL17R antibody,anti-IL17R Ab)干預(yù)HepG2.2.15細(xì)胞,CCK8比色法檢測細(xì)胞的增殖情況。分別用含有1ng/ml IL17,1ng/ml抗IL17抗體和(?)1μg/ml阿德福韋酯的細(xì)胞培養(yǎng)液作用于HepG2.2.15細(xì)胞,加藥后3d收集培養(yǎng)上清液,5d收集上清液和細(xì)胞,用Real-time PCR方法檢測上清和細(xì)胞內(nèi)HBV DNA、(?)電化學(xué)發(fā)光方法檢測細(xì)胞上清的HBsAg和HBeAg。應(yīng)用單因素方差分析(One-way analysis of variance,ANVOA)和Dunnett's test用來比較各組間的差別。 結(jié)果:(1)不同濃度水平的IL17組和anti-IL17R Ab組間及與空白對照組比較HepG2.2.15細(xì)胞CCK8值均無明顯差別(表1-2,P0.05)。IL17對細(xì)胞的增殖無抑制和促進(jìn)作用。 (2)IL17組細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平明顯低于正常對照組(6.79±0.15,7.14±0.13,P005);anti-IL17R Ab組細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平明顯高于正常對照組(7.47±0.16,7.14±0.13,P0.05):阿德福韋酯組細(xì)胞內(nèi)HBVDNA水平明顯低于正常對照組、IL17組和anti-IL17R Ab組(6.11±0.36,P0.05)。 (3)3d和5d時(shí)IL17組細(xì)胞上清液中HBV DNA水平與正常對照組間無明顯差異(4.67±0.31,4.47±0.34,P0.05;4.70±0.34,4.57±0.38,P0.05);3d和15d(?)anti-IL17R Ab組細(xì)胞上清液中HBV DNA水平明顯高于正常對照組(5.00±0.21,4.47±0.34,P0.05;5.10±0.21,4.57±0.38,P0.05);3d和5d時(shí)阿德福韋酯組細(xì)胞上清液HBVDNA水平明顯低于正常對照組、IL17組和anti-IL17R Ab組(3.59±0.49,P0.05;3.35±0.44,P0.05)。 (4)IL17組3d時(shí)細(xì)胞上清液中(?)HBsAg水平與正常對照組比較無明顯差異(9.71±1.55,10.72±0.95,P0.05),5d時(shí)細(xì)胞上清液中(?)BsAg水平低于正常對照組(7.56±0.60,9.19±1.20,P0.05);anti IL17R Ab組3d時(shí)細(xì)胞上清液HBsAg水平高于正常對照組(12.78±0.96,10.72±0.95,P0.05),5天時(shí)細(xì)胞上清液HBsAg(?)水平與正常對照組無明顯差異(10.72±1.16,9.19±1.20,P0.05);3d和5d阿德福韋酯組細(xì)胞上清液HBsAg水平與正常對照組比較無明顯差異(9.41±1.65,10.72±0.95,,P0.05;9.78±1.23,9.19±1.20,P0.05)。 (5)3d和5d IL17組細(xì)胞細(xì)胞上清液中HBcAg水平低于正常對照組(34.90±3.68,43.10±5.46,P0.05;24.92±6.18,43.95±6.64,P0.05);3d和(?)5d anti-IL17R Ab組細(xì)胞上清液HBeAg水平與正常對照組比較無明顯差異(45.07±4.33,43.10±5.46,P0.05;48.31±9.49,43.95±6.64,P0.05);3d和5d阿德福韋酯組細(xì)胞上清液HBeAg水平與正常對照組比較無明顯差異(40.56±6.12,43.10±5.46,P0.05;41.51±4.88,43.95±6.64,P0.05)。 (6)4ng/ml,lng/ml,250pg/ml IL17組間比較,細(xì)胞上清液中HBV DNA, HBsAg,HBeAg,細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平均無明顯差異(表1-6,P0.05)。第5天IL17可降低細(xì)胞上清液HBsAg水平,第3天IL17無法降低HBsAg水平;第5天IL17對細(xì)胞上清液HBeAg的抑制率43.31%,第3天對細(xì)胞上清液HBeAg的抑制率為19.04%。 結(jié)論:IL17對HepG2.2.15細(xì)胞增殖無抑制和促進(jìn)作用。IL17可在不產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用的情況下,對HepG2.2.15細(xì)胞系內(nèi)的HBV復(fù)制產(chǎn)生抑制作用。IL17的抑制作用在250pg/ml至4ng/ml濃度范圍內(nèi)無濃度依賴性,有時(shí)間依賴性。IL17與阿德福韋酯間抗病毒作用機(jī)制不同。 第二部分IL22在肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15中抑制HBV復(fù)制的研究 目的:探究IL22在可持續(xù)分泌HBV的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15中抑制HBV復(fù)制的作用。 方法:分別用含有不同濃度(4ng/ml、1ng/ml和250pg/ml)的IL22和抗IL22抗體(anti-IL22R antibody,anti-IL22R Ab)干預(yù)HopG2.2.15細(xì)胞,CCK8比色法檢測細(xì)胞的增殖情況。分別用含有1ng/ml IL22, lng/ml anti-IL22R Ab和(?)1μg/ml阿德福韋酯的細(xì)胞培養(yǎng)液作用于HepG2.2.15細(xì)胞,加藥后3d收集培養(yǎng)上清液,5d收集上清液和細(xì)胞,用Real-time PCR方法檢測上清和細(xì)胞內(nèi)HBV DNA、電化學(xué)發(fā)光方法檢測細(xì)胞上清的(?)BsAg和HBeAg。應(yīng)用(?)ANVOA和Dunnett's test用來比較各組間的差別。 結(jié)果:(1)不同濃度水平的IL22組和(?)anti-IL22R Ab組間及與空白對照組比較HepG2.2.15細(xì)胞CCK8值均無明顯差別(表2-1,P0.05)。IL22對細(xì)胞的增殖無抑制和促進(jìn)作用。 (2)IL22組細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水與正常對照組比較無明顯差異(7.28±0.26,7.14±0.13,P0.05);anti-IL22Ab組細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平與正常對照組比較無明顯差異(7.24±0.17,7.14±0.13,P0.05)。 (3)3d和5d時(shí)IL22組細(xì)胞上清液中HBV DNA水平與正常對照組間無明顯差異(4.87±0.63,4.47±0.34,P0.05;4.68±0.70,4.57±0.38,P0.05);3d和5d時(shí)anti-IL22R Ab組細(xì)胞上清液HBV DNA水平與正常對照組比較無明顯差異(4.70±0.50,4.47±0.34,P0.05;4.77±0.33,4.57±0.38,P0.05); (4)3d和5d時(shí)IL22組細(xì)胞上清液中HBsAg水平與正常對照組比較無明顯差異(11.07±1.15,10.72±0.95,P0.05;8.99±0.42,9.19±1.20,P0.05);3d和5d時(shí)anti-IL22R Ab組細(xì)胞上清液HBsAg水平與正常對照組間無明顯差異(9.80±1.50,10.72±0.95,P0.05;10.27±1.24,9.19±1.20,P0.05)。 (5)3d和5d時(shí)IL22組細(xì)胞細(xì)胞上清液中HBeAg與正常對照組水平無明顯異常(45.42±6.80,43.10±5.46,P0.05;37.80±7.55,43.95±6.64,P0.05):3d和5d時(shí)(?)anti-IL22R Ab細(xì)胞上清液HBeAg水平與正常對照組比較無明顯差異(40.06±4.29,43.10±5.46,P0.05:39.45±6.99,43.95±6.64,P0.05)。 結(jié)論:IL22(?)HepG2.2.15細(xì)胞增殖無明顯抑制和促進(jìn)作用,對HepG2.2.15細(xì)胞系內(nèi)的HBV復(fù)制無明顯抑制作用。 第三部分IL17對HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)部分抗病毒蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 目的:探究IL17對HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)部分抗病毒蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。探究其與IL17抗HBV作用之間的關(guān)系。 方法:1ng/ml IL17干預(yù)HepG2.2.15細(xì)胞。選取部分抗病毒蛋白如抗粘病毒蛋白A(MxA)、2’5’寡腺苷酸合成酶(OAS)、干擾毒刺激基因因子3(ISGF3)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子1(STAT1)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子2(STAT2),Reak-timeRT-PCR方法檢測IL17作用72h后HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)OAS、STAT1、STAT2、1SGF3和MxA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAQ水平變化,以β-actino基因(?)mRNA作為檢測內(nèi)參照。用(?)MxA siRNA和IOAS siRNA誘導(dǎo)沉默HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)MxA和OAS基因轉(zhuǎn)錄,Real time RT-PCR方法檢測IL17作用下MxA和OAS基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA水平變化,Real timePCR方法檢HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平變化。應(yīng)用ANVOA和(?)Dunnett's test用來比較各組間的差別。 結(jié)果:(1)IL17作用后HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)MxA和OAS轉(zhuǎn)錄水平與對照組比值為16.56(P0.05)和19.88(P0.05);STAT1, STAT2, ISGF3轉(zhuǎn)錄水平與對照組比值為1.67(P0.05)、1.98(P0.05)和1.93(P0.05) (2) MxA siRNA可有效沉默IL17誘導(dǎo)的MxA轉(zhuǎn)錄(沉默效率為82.63%),同步檢測(?)MxA siRNA組細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平較對照組明顯升高(7.09±0.21,6.76±0.28,P0.05)。 (3) OAS siRNA可有效沉默IL17誘導(dǎo)的OAS轉(zhuǎn)錄(沉默效率為81.07%),同步檢測(?)OAS siRNA組細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平較對照組明顯升高(7.19±0.13,6.76±0.28,P0.05) 結(jié)論:IL17作用可以誘導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)MxA和(?)OAS基因活躍轉(zhuǎn)錄,并產(chǎn)生抑制HBV復(fù)制的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】:山東大學(xué)
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2013
【分類號】:R512.62

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3 張建中;阿德福韋酯的合成優(yōu)化研究[D];南京理工大學(xué);2013年

4 陳永青;龍柴方聯(lián)合阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎臨床研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

5 吳碧琛;自身免疫性糖尿病患者外周血中Th17細(xì)胞頻率的比較[D];中南大學(xué);2012年

6 黃燕;T淋巴細(xì)胞亞群水平對阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎療效的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

7 谷曉晶;恩替卡韋和阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎三年的隨機(jī)對照研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

8 高峰;干擾素α-2b與阿德福韋酯聯(lián)合治療慢性乙型肝炎患者療效觀察[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

9 廖非;TH17相關(guān)細(xì)胞因子與銀屑病及白癜風(fēng)的關(guān)聯(lián)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2009年

10 劉潔;阿德福韋酯治療前后乙型肝炎病毒耐藥變異情況及與基因型相關(guān)性的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2010年

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本文編號:1601962

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