本文選題：丙型肝炎病毒　切入點(diǎn)：病毒復(fù)制　出處：《武漢大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：丙型肝炎病毒(HCV)隸屬黃病毒科,其毒粒僅包含單一的9.6kb正鏈基因組RNA作為遺傳信息的載體和病毒早期開始翻譯的模板,外層由Core蛋白組成的核衣殼和結(jié)合了E1、E2糖蛋白的包膜組成。HCV從二十世紀(jì)開始傳播至今,已在全世界范圍內(nèi)感染大約1.7億人口,成為人類健康的嚴(yán)重威脅,對(duì)社會(huì)造成了巨大的衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)損失。HCV在肝臟內(nèi)造成感染的細(xì)胞僅占很小比例,但由它逃逸宿主免疫形成慢性感染和宿主的持續(xù)性炎癥應(yīng)答,將會(huì)造成長(zhǎng)期的肝臟損傷,是導(dǎo)致病情發(fā)展為脂肪肝、肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要誘因。HCV感染在肝臟內(nèi)調(diào)節(jié)多種脂肪代謝基因,誘發(fā)的肝細(xì)胞質(zhì)大量積累脂滴,也是推動(dòng)病程發(fā)展,削弱干擾素聯(lián)合治療效果的重要原因。病毒在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過程中通過自身表達(dá)非結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)和組建其復(fù)制復(fù)合物的產(chǎn)生,這個(gè)過程中也需要招募眾多宿主蛋白行使功能。本研究的初衷即尋找人肝組織中表達(dá),但是參與到HCV復(fù)制過程中的宿主蛋白,研究其中原理和抑制病毒復(fù)制的新方向。首先我們通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選出若干可能與HCV蛋白相互作用的宿主因子,從中選取了與病毒基因組復(fù)制必須的——以RNA為模板的RNA多聚酶,即HCV NS5B相互作用的細(xì)胞色素P450家族4亞族F多肽12(CYP4F12)作為繼續(xù)研究的靶標(biāo)。經(jīng)過CoIP,熒光共聚焦和分離HCV CRC實(shí)驗(yàn),我們確定了CYP4F12蛋白通過NS5B中段的手掌部結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)相互作用。在活細(xì)胞內(nèi)模擬NS5B結(jié)合病毒負(fù)鏈RNA上逆向5’-UTR合成基因組RNA的過程,發(fā)現(xiàn)CYP4F12能夠提高NS5B的聚合酶活性。并且在HCV復(fù)制子系統(tǒng)和JFH-1活病毒感染體系中,我們觀察到外源表達(dá)CYP4F12對(duì)病毒RNA水平的蛋白水平的增強(qiáng)作用,敲減內(nèi)源CYP4F12則會(huì)降低HCV復(fù)制水平。由于沒有CYP4F12啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和調(diào)控的具體研究報(bào)道,我們經(jīng)過篩選構(gòu)建了它的啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒,并通過一系列的實(shí)驗(yàn)分析確定了上面的p50和SREBP1結(jié)合位點(diǎn)的具體位置,以及兩者之間不存在協(xié)同激活,反而在相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合空間的關(guān)系。并以這些結(jié)果為基礎(chǔ),研究發(fā)現(xiàn)了：HCV在感染細(xì)胞過程中上調(diào)p50和SREBP1水平；HCV NS3/4A特異的增強(qiáng)CYP4F12啟動(dòng)子上SRE和SREBP1的結(jié)合,而p7蛋白則對(duì)p50結(jié)合有一定促進(jìn)。從而揭示HCV感染中對(duì)CYP4F12的誘導(dǎo)調(diào)控方式。同時(shí),初步探索了HCV對(duì)CYP4F亞族其他成員的影響,發(fā)現(xiàn)CYP4F11受到和CYP4F12類似的調(diào)節(jié),并且幅度更大。本實(shí)驗(yàn)首次將細(xì)胞色素酶P450和HCV聯(lián)系在一起,為進(jìn)一步理解HCV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過程提供了新的信息,并指出了HCV影響細(xì)胞脂類代謝的另一個(gè)途徑。
[Abstract]:Hepatitis C virus (HCV) belongs to the family Flavoviridae and contains only a single 9.6kb positive strand genomic RNA as a carrier of genetic information and a template for early translation of the virus. The outer core-capsid composed of Core protein and the envelope composed of E1OE2 glycoprotein. HCV has been infected about 170 million people worldwide since 20th century, and has become a serious threat to human health. Great health and economic losses to society. HCV causes only a small percentage of infected cells in the liver, but chronic infection and persistent inflammatory response from which it escapes will cause long-term liver damage. HCV infection regulates a variety of fat metabolism genes in the liver, and induces a large accumulation of lipid droplets in the liver cytoplasm, which also promotes the development of the course of disease. The important reason for weakening the effect of interferon combination therapy is that the virus induces and forms its replication complex by self-expression of non-structural proteins during the process of replication in hepatocytes. The original purpose of this study is to look for host proteins expressed in human liver tissues but involved in the process of HCV replication. First, we screened out some host factors which may interact with HCV protein by yeast two-hybrid experiment. RNA polymerase based on RNA was selected as the target for further study. It was the cytochrome P450 family member F polypeptide 12CYP 4F12 that interacted with HCV NS5B. After CoIP, fluorescence confocal focusing and isolation of HCV CRC, We have determined that the CYP4F12 protein interacts through the palm structure of the midpiece of NS5B. In living cells, we mimic the synthesis of genomic RNA by reverse 5H-UTR on the negative RNA of NS5B binding virus. It was found that CYP4F12 could increase the polymerase activity of NS5B, and in the HCV replication subsystem and JFH-1 virus infection system, we observed that exogenous expression of CYP4F12 could enhance the protein level of viral RNA. Knockout of endogenous CYP4F12 reduces the level of HCV replication. Since there are no specific studies on the promoter structure and regulation of CYP4F12, we have screened and constructed its promoter reporter plasmid. Through a series of experimental analyses, the specific position of the above p50 and SREBP1 binding sites is determined, and the relationship between the above p50 and SREBP1 binding sites is not synergistically activated, but in the competitive binding space, and based on these results, It has been found that the level of p50 and SREBP1 is up-regulated in the process of infection of SRE and SREBP1, and HCV NS3/4A specifically enhances the binding of SRE and SREBP1 on CYP4F12 promoter, while p7 protein promotes the binding of p50, thus revealing the induced regulation of CYP4F12 in HCV infection. The effects of HCV on other members of CYP4F subfamily were preliminarily explored, and it was found that CYP4F11 was regulated by CYP4F12 to a much greater extent. In this study, cytochrome P450 and HCV were first linked together. It provides new information for further understanding the process of HCV replication in cells and points out another way for HCV to affect lipid metabolism of cells.
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.63

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本文編號(hào)：1580378