本文選題：分枝桿菌　切入點(diǎn)：絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病仍然是目前危害人類(lèi)健康的慢性傳染病。由于結(jié)核分枝桿菌的多耐藥性和廣耐藥性，加之與艾滋病毒的互作，使得結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率不斷地增加，因此研發(fā)新的抗結(jié)核的藥物迫在眉睫。L-半胱氨酸(L-cys)是重要的含硫氨基酸，參與L-蛋氨酸、二級(jí)代謝物、輔酶A等含硫化合物的生物合成。微生物的半胱氨酸合成由絲氨酸經(jīng)過(guò)絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶(SAT/CysE)轉(zhuǎn)化為氧乙酰絲氨酸，再在氧乙酰絲氨酸硫解酶的作用下，，最終轉(zhuǎn)化為半胱氨酸。絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶參與半胱氨酸合成的第一步反應(yīng)，將絲氨酸最終轉(zhuǎn)化為半胱氨酸。這條合成半胱氨酸的途徑僅存在于植物和微生物中，與人體中合成半胱氨酸的途徑完全不同。因此，絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶是抗結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)。 本論文的目的：(1)確定恥垢分枝桿菌中表達(dá)絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶的基因，確認(rèn)其絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶的功能。研究敲除絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶的基因后對(duì)恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)及代謝的影響，以確定它的抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)的特性，同時(shí)尋找更多的潛在的藥物作用的靶點(diǎn)。(2)通過(guò)點(diǎn)突變了解乙�；D(zhuǎn)移酶的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，確定結(jié)核分枝桿菌的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性位點(diǎn)。通過(guò)優(yōu)化結(jié)核分枝桿菌的絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶的表達(dá)及了解酶學(xué)特征，為建立高通量篩選酶抑制劑的模型及定向設(shè)計(jì)酶抑制劑提供理論依據(jù)。 本論文的方法和結(jié)果如下： 1.恥垢分枝桿菌基因MSMEG_5947的克隆表達(dá)以及活性測(cè)定。 PCR擴(kuò)增基因MSMEG_5947，構(gòu)建克隆載體pMD18-MSMEG_5947。DNA序列測(cè)定正確后構(gòu)建用于表達(dá)的載體pET16-MSMEG_5947和pCold-MSMEG_5947，將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)中。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)MSMEG_5947蛋白表達(dá)。Ni-NTA-Agarose親和層析柱純化在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)的目的蛋白。SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)到了純化的MSMEG_5947蛋白。DTNB (Ellman)法檢測(cè)到了表達(dá)的蛋白的絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶的活性。 2..恥垢分枝桿菌基因MSMEG_5947敲除菌株的構(gòu)建以及基因缺失后的影響 (1) MSMEG_5947基因敲除菌株的構(gòu)建 PCR擴(kuò)增基因MSMEG_5947基因及其上游約696bp的DNA序列，并將其克隆到pMD18-T上，測(cè)序后的序列與恥垢分枝桿菌基因組上MSMEG_5947基因序列完全一致的陽(yáng)性質(zhì)粒用于下面的實(shí)驗(yàn)。將來(lái)自于質(zhì)粒pUC4K的KanR的片段克隆到MSMEG_5947基因內(nèi)，產(chǎn)生MSMEG_5947::KanR突變基因。將MSMEG_5947::KanR突變基因克隆到質(zhì)粒pPR27-xylE，構(gòu)建了條件性復(fù)制質(zhì)粒pPR27-xylE-MSMEG_5947::KanR。 PCR擴(kuò)增cysE基因，并將其克隆到pMD18-T上，測(cè)序正確后將它連接到pET23b質(zhì)粒上，再連同該質(zhì)粒上的啟動(dòng)子一起連接到質(zhì)粒營(yíng)救質(zhì)粒pCG76。構(gòu)建了營(yíng)救質(zhì)粒pCG76-Phsp60-cysE。 將條件復(fù)制性質(zhì)粒pPR27-xylE-MSMEG_5947::KanR電轉(zhuǎn)化到恥垢分枝桿菌中。在42C條件下迫使pPR27-xylE-MSMEG_5947::KanR質(zhì)粒中的MSMEG_5947::KanR與恥垢分枝桿菌的基因組中的MSMEG_5947發(fā)生同源重組， MSMEG_5947::KanR以及sacB基因、xylE基因整合到基因組中。Southern印跡和PCR的方法分析篩選出了發(fā)生第一次同源重組的菌株（mc2155MSMEG_5947SOC-1）。 營(yíng)救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到mc2155MSMEG_5947SOC-1中，在30C條件下，用10%蔗糖的壓力選擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的mc2155MSMEG_5947SCO-1，在這種選擇壓力下，mc2155MSMEG_5947SCO-1基因組中的MSMEG_5947::KanR與MSMEG_5947發(fā)生第二次同源重組，將MSMEG_5947基因、sacB基因以及xylE基因從mc2155MSMEG_5947SCO-1基因組中刪除掉只留下MSMEG_5947::KanR。用Southern印跡和PCR方法篩選出MSMEG_5947基因敲除菌株(SM-ΔM_5947stain)。 (2) MSMEG_5947基因敲除菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn) MSMEG_5947基因敲除菌株在每間隔24小時(shí)測(cè)定30C和42C條件下的OD600nm的值，繪制敲除菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。相比于野生型菌株，敲除菌株的生長(zhǎng)在30C的條件下沒(méi)有變化。在42C的條件下，基因敲除菌株的生長(zhǎng)相比于野生型的菌株有滯緩。因而說(shuō)明了MSMEG_5947基因?qū)Ψ种U菌生長(zhǎng)有影響。 (3) MSMEG_5947基因敲除菌株的電鏡觀察 用掃描電鏡和透射電鏡觀察MSMEG_5947基因敲除菌株在42C條件下培養(yǎng)后的形態(tài)的變化。相比于野生型的菌株，敲除菌株的形態(tài)在對(duì)數(shù)期發(fā)生了了明顯的變化。菌體末端出現(xiàn)膨大，菌體內(nèi)部出現(xiàn)了大量的空泡。因而MSMEG_5947基因?qū)Ψ种U菌的形態(tài)有影響， (4) MSMEG_5947基因敲除菌株的蛋白質(zhì)組學(xué)的分析 用雙向電泳分析基因敲除后的菌株相比與正常的菌株的蛋白質(zhì)組學(xué)。利用Image J軟件對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行分析匹配，發(fā)現(xiàn)差異的蛋白點(diǎn)。MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，在Matrix Science-Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)中查找比對(duì)，對(duì)每個(gè)差異點(diǎn)選出匹配度最高的蛋白。對(duì)結(jié)核分枝桿菌蛋白相應(yīng)編碼基因進(jìn)行功能學(xué)分類(lèi)，找到與結(jié)核分枝桿菌代謝有關(guān)的酶。 3.結(jié)核分枝桿菌絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶同源模型的建立 用一些生物信息學(xué)軟件，例如ProtParam，Inter-ProScan, PSIPRED, NCBIConserved Domains Database和SWISS-MODEL等分析結(jié)核分枝桿菌絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)以及空間結(jié)構(gòu)模型。 4.結(jié)核分枝桿菌絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶的表達(dá)，活性測(cè)定及動(dòng)力學(xué)特性的分析 用pCold質(zhì)粒優(yōu)化表達(dá)結(jié)核分枝桿菌的絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶。HPLC和DTNB (Ellman)法測(cè)定絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶的活性。測(cè)定了該酶的最適反應(yīng)條件和酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù)。絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶的比活度是10.66±0.44μmol/min/mg，最適反應(yīng)溫度是37C，最適pH是7.5。 5.結(jié)核分枝桿菌乙�；D(zhuǎn)移酶氨基酸定點(diǎn)突變 利用反向PCR及分子克隆技術(shù)構(gòu)建出3種pET29-cysE-M突變重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中。蛋白質(zhì)印跡分析表明突變蛋白可以表達(dá)，但是表達(dá)量不高。HPLC分析酶活性，突變體都具有絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，用DTNB分析酶活性變化，突變體的酶的活性相對(duì)于正常的酶的活性都有所降低。 結(jié)論： 1.恥垢分枝桿菌中絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶的基因確認(rèn)為MSMEG_5947，但是是非必需的基因。 2.絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶的基因敲除后的蛋白質(zhì)有差異。差異的蛋白與分枝桿菌的能量代謝和蛋白的合成有關(guān)。 3.結(jié)核分枝桿菌的絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知，它具有一個(gè)保守的左手β螺旋是該酶活性有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。 4.絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶的67位天冬氨酸，82位的組氨酸，117位的組氨酸是與其活性有關(guān)的位點(diǎn)。 未來(lái)研究方向： 1.用雙向電泳進(jìn)一步的篩選和鑒定絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因敲除后的差異蛋白； 2.利用Real-Time PCR對(duì)恥垢分枝桿菌氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因敲除菌株的差異蛋白在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化進(jìn)行測(cè)定。 3.利用高通量篩選、定向設(shè)計(jì)抑制劑法尋找結(jié)核分枝桿菌的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑。 4.測(cè)定CysE蛋白晶體結(jié)構(gòu)，觀察底物與酶蛋白的相互作用的機(jī)制 5.用基因的定點(diǎn)突變，篩選更多的與活性有關(guān)的位點(diǎn)，并研究發(fā)生突變的絲氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶的動(dòng)力學(xué)特性，來(lái)確定活性位點(diǎn)的作用。
[Abstract]:Tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis is still a chronic infectious disease to human health hazards. At present due to Mycobacterium tuberculosis multidrug resistance and wide resistance, coupled with the interaction of HIV, TB incidence and mortality rates continue to increase, so the development of new anti tuberculosis drugs (L-cys) is imminent.L- cysteine sulfur amino acid important, participate in the L- two levels of methionine, metabolites, biosynthesis of coenzyme A and other sulfur-containing compounds. The microbial synthesis of cysteine by serine by serine acetyltransferase (SAT/CysE) into o-acetyl-l-sedne, then solution enzyme in o-acetyl-l-sedne sulfur under the effect of final conversion to cysteine. Serine acetyltransferase involved in the first step reaction synthesis of cysteine, serine will eventually transformed into cysteine. Synthesis pathway that cysteine exists only in the In plants and microbes, the way to synthesize cysteine is completely different from human body. Therefore, serine acetyltransferase is a potential drug target against Mycobacterium tuberculosis.
The aim of this paper is: (1) to determine the expression of serine acetyltransferase gene of Mycobacterium smegmatis, confirm its serine acetyltransferase function. Study on the effects of knocking out the growth and metabolism of Mycobacterium smegmatis serine acetyltransferase gene, to determine the characteristics of its anti tuberculosis drug target, target and search the drug potentially more. (2) to understand the relationship between acetyltransfer spatial structure and function of the enzyme by point mutation, determine the Mycobacterium tuberculosis serine acetyltransferase acetyl serine active site of the enzyme. Through the optimization of Mycobacterium tuberculosis transferase expression and understanding enzymological characteristics, provide a theoretical basis for the design of enzyme inhibitors and directed model establishment of high-throughput screening enzyme inhibitors.
The methods and results of this paper are as follows:
Cloning and expression of 1. Mycobacterium scale Mycobacterium MSMEG_5947 and determination of its activity.
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本文編號(hào)：1577065