本文選題：丙型肝炎病毒　切入點(diǎn)：抗病毒多肽　出處：《武漢大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：丙型肝炎病毒(HCV)是一種正鏈RNA病毒,在分類學(xué)上屬于黃病毒科。HCV是慢性肝炎,肝硬化和肝癌等慢性肝病的主要誘因,目前在全球范圍內(nèi)大約有2億人被感染。多年以來,臨床上主要依靠干擾素配合病毒唑的雞尾酒療法來治療HCV的感染,近年來發(fā)展了蛋白酶抑制劑配合上述二聯(lián)療法的新型抗病毒模式,并取得了一定的治療效果。但是由于藥物副作用、耐藥性的產(chǎn)生以及患者的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答存在差異等因素,現(xiàn)行治療方法并不能滿足臨床的需要。同時(shí),由于缺乏有效的疫苗來對(duì)HCV的感染進(jìn)行預(yù)防,尋找并開發(fā)新型的抗HCV藥物顯得尤為重要。 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了西藏特里豚蝎和三脊豚蝎毒腺組織cDNA文庫,并從中發(fā)現(xiàn)了13條具有潛在抗微生物功能的多肽分子。通過化學(xué)合成的方法獲得了這13條多肽,從中發(fā)現(xiàn)了具有抗HCV感染功能的多肽Ctry2459。在體外條件下,Ctry2459多肽能夠采用一種“剝膜”的方式將HCV的包膜和核殼結(jié)構(gòu)分離,從而有效抑制HCV的早期感染,但不影響病毒的核殼及其RNA。這種抑制作用具有快速高效的特點(diǎn),Ctry2459多肽抑制HCV感染的半數(shù)有效濃度(EC50)為1.84μg/ml,對(duì)Huh7.5.1細(xì)胞系的半數(shù)毒性濃度(CC50)為79.8μg/ml,藥物選擇指數(shù)(SI)為43.4,半數(shù)溶血濃度(HCs0)為137.9μg/ml,表現(xiàn)出了較好的藥理學(xué)性能。 盡管天然蝎毒肽Ctry2459具有一定的抗HCV感染作用,但它缺乏對(duì)HCV的感染后抑制功能。這種功能缺陷是由于Ctry2459多肽的細(xì)胞攝取量低并受到細(xì)胞內(nèi)含體的限制,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞攝取和內(nèi)含體通路能夠有效改善它的生物利用度。在此基礎(chǔ)上,以天然多肽Ctry2459為分子模板,設(shè)計(jì)了兩條富含組氨酸的衍生肽Ctry2459-H2和Ctry2459-H3。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),衍生肽Ctry2459-H2和Ctry2459-H3保持了與天然多肽Ctry2459類似的α螺旋結(jié)構(gòu)以及抑制HCV初期感染的功能,它們抑制HCV感染的作用也具有快速高效的特點(diǎn),EC50分別為1.08μg/ml和0.85μg/ml。通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Ctry2459衍生肽能夠有效地突破細(xì)胞攝取和內(nèi)含體的障礙,從而發(fā)揮對(duì)HCV感染后的抑制作用。在HCV感染48小時(shí)后使用20μg/ml Ctry2459-H2和Ctry2459-H3多肽進(jìn)行處理,可以分別抑制細(xì)胞內(nèi)40%和70%的HCV含量。此外,研究也發(fā)現(xiàn)Ctry2459-H2和Ctry2459-H3多肽具有更低的細(xì)胞毒性和溶血性,CC50均大于500μg/ml, HC50分別為203.3μg/ml和416.4μg/ml。因此,與天然多肽Ctry2459相比,衍生肽Ctry2459-H2和Ctry2459-H3展示出了更高的成藥性。 另外,本研究依據(jù)HCVp7離子通道的結(jié)構(gòu)和功能特征,從其跨膜結(jié)構(gòu)域截取了4條可能具有干擾正常通道組裝的多肽序列。通過化學(xué)合成的方法獲得了多肽,并從中發(fā)現(xiàn)了對(duì)HCV具有感染后抑制作用的多肽p7avp3。體外條件下,p7avp3多肽能夠有效抑制HCV的感染后增殖,其EC5o為2.19±0.16μM,CC50為83.64±6.95μM,藥物選擇指數(shù)為38.19。盡管p7avp3多肽具有一定的抗HCV功能,但是它的藥物選擇指數(shù)較低,因此需要對(duì)其藥理學(xué)性能進(jìn)行優(yōu)化。在p7avp3多肽的基礎(chǔ)上,根據(jù)氨基酸的極性以及電荷等特征,設(shè)計(jì)了10條新的衍生肽,并從中發(fā)現(xiàn)了比p7avp3抗病毒功能更強(qiáng)的多肽p7avp5。體外條件下,p7avp5多肽能夠高效抑制HCV的感染后增殖,其ECso為1.09±0.13μM,CC50為115.99±16.68μM,藥物選擇指數(shù)為106.41,展示出了更好的藥理學(xué)性質(zhì)。此外,p7avp3和p7avp5多肽均表現(xiàn)出了較低的溶血性以及較高的血清穩(wěn)定性。 進(jìn)一步開展了p7avp5多肽抗HCV的機(jī)制研究。通過不同給藥方式的抗病毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),p7avp5多肽可以在多種條件下抵抗HCV的感染,包括作用于細(xì)胞和病毒來抑制病毒早期感染,抑制病毒的入侵和感染后增殖。其中,當(dāng)p7avp5多肽直接作用于HCV時(shí),抗病毒功能最高效,且不依賴于對(duì)病毒核酸的破壞。用FITC標(biāo)記多肽并在共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),p7avp5多肽能夠快速吸附到細(xì)胞膜上并導(dǎo)致HCV感染的下降,隨著時(shí)間的推移,p7avp5多肽逐漸在細(xì)胞膜上富集并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)病毒粒子的感染性下降。因此,p7avp5多肽可能采取了三種作用模式來發(fā)揮抗HCV功能,包括封閉細(xì)胞和鈍化病毒抑制早期感染,以及進(jìn)入細(xì)胞鈍化病毒來抑制二次感染。此外,電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,p7avp5多肽不影響p7離子通道的正常組裝及其生理功能,也不阻斷其電流,并且不抑制HCV從宿主細(xì)胞的釋放過程。 綜上所述,本研究從蝎活性多肽資源庫中發(fā)現(xiàn)了新的天然抗HCV多肽分子Ctry2459,通過對(duì)其合理的優(yōu)化設(shè)計(jì)獲得了具有高生物利用度以及抗HCV功能的衍生肽。同時(shí),以HCVp7離子通道為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)并鑒定了新的抗HCV多肽分子p7avp5,解析了該多肽的抗HCV功能與機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)了具有潛在應(yīng)用價(jià)值的抗HCV多肽分子,豐富了現(xiàn)有的抗病毒多肽開發(fā)策略,并為天然動(dòng)物毒素多肽的開發(fā)利用以及新型抗病毒多肽的篩選和設(shè)計(jì)提供了理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。
[Abstract]:Hepatitis C virus (HCV) is a positive strand RNA virus belonging to the Flaviviridae family, in the taxonomy of.HCV is main cause of chronic hepatitis, cirrhosis and liver cancer and other chronic liver disease worldwide, currently about 200 million people have been infected. Over the years, mainly rely on clinical infection cocktail therapy with interferon ribavirin treatment HCV, a new antiviral model developed in recent years with the two protease inhibitor combination therapy, and achieved a certain therapeutic effect. But due to the side effects of the drug resistance, and the patients with sustained viral response to existence differences and other factors, the current treatment methods can not meet the clinical needs. At the same time, due to the lack of effective the HCV vaccine to prevent infection, to find and develop new anti HCV drugs is particularly important.
The cDNA library was constructed for the Tibet dolphins and three ridge dolphin Terry scorpion scorpion BmK organization, and found 13 potential anti microbial peptides from. By the method of chemical synthesis for the 13 peptides, found with anti HCV infection function of peptide Ctry2459. in vitro, Ctry2459 peptides can adopts a "stripping" will be coated HCV and core-shell structure separation, which can effectively inhibit early HCV infection, but does not affect the nuclear shell virus RNA. and this inhibition is fast and efficient, Ctry2459 inhibit Iabour HCV infection (EC50) for 1.84 g/ml. The median toxic concentrations of Huh7.5.1 cell lines (CC50) for 79.8 g/ml, the drug selection index (SI) was 43.4, half hemolytic concentration (HCs0) of 137.9 g/ml, showing the pharmacology of good performance.
Although natural scorpion venom peptide Ctry2459 has certain anti HCV infection, but its lack of inhibition function of HCV after infection. This defect is due to the cellular uptake of Ctry2459 polypeptide was low and cell inclusions constraints, improve its bioavailability through regulation of cell uptake and inclusion based pathways. On the natural peptide Ctry2459 is a template for the design of the two histidine rich peptides derived from Ctry2459-H2 and Ctry2459-H3. further study found that Ctry2459-H2 and Ctry2459-H3 derived peptides maintain alpha helix and natural polypeptide Ctry2459 similar function and inhibition of HCV infection early, they inhibit HCV infection also has the characteristics of fast and efficient. EC50 were 1.08 g/ml and 0.85 g/ml. by confocal microscopy observation showed that Ctry2459 derived peptide can effectively break cell uptake and containing The obstacles to exert inhibitory effect on HCV after infection were treated using 20 g/ml Ctry2459-H2 and Ctry2459-H3 polypeptide in HCV after 48 hours of infection, can the content of HCV in cells 40% and 70% were inhibited. In addition, the study also found that Ctry2459-H2 and Ctry2459-H3 polypeptides with lower cytotoxicity and hemolysis, CC50 more than 500 g/ml, HC50 were 203.3 g/ml and 416.4 g/ml., therefore, compared with the natural peptide Ctry2459 derived peptide, Ctry2459-H2 and Ctry2459-H3 showed a higher resistance.
In addition, on the basis of the structure and function of the HCVp7 ion channel characteristics, from its transmembrane domain from 4 may interfere with normal channel assembly of peptide sequence. By the method of chemical synthesis of peptides obtained, and from that of HCV after infection has inhibitory effect of polypeptide p7avp3. in vitro, p7avp3 peptide can effectively inhibit HCV proliferation after infection, the EC5o was 2.19 + 0.16 M, CC50 83.64 + 6.95 M, drug selection index was 38.19. while the p7avp3 polypeptide with anti HCV function, but its drug selection index is low, so the need for its pharmacological properties were optimized. Based on p7avp3 polypeptide according to the amino acid, polarity and charge characteristics, we design 10 new derived peptides, and find the more powerful than p7avp3 antiviral polypeptide p7avp5. in vitro, p7avp5 peptides can inhibit HCV high efficiency After infection, the ECso was 1.09 + 0.13 M, CC50 was 115.99 + 16.68 M, and the drug selection index was 106.41, showing better pharmacological properties. In addition, p7avp3 and p7avp5 peptides showed low hemolysis and high serum stability.
Further research on the mechanism of p7avp5 anti HCV polypeptide. The antiviral effect of different ways of administration found that peptide p7avp5 in a variety of conditions against HCV infection, including the effect on the cell and virus to inhibit early infection, inhibit the virus invasion and infection after proliferation. Among them, when the p7avp5 peptide directly on the HCV and the most efficient antiviral function, and does not depend on the viral nucleic acid damage. Observed by confocal microscopy and FITC labeled peptide, p7avp5 peptide can rapidly adsorbed to the cell membrane and lead to a decline in HCV infection, with the passage of time, gradually p7avp5 polypeptides in the cell membrane into the cytoplasm and enrichment of lead to infection. Viral particles in cells decreased. Therefore, p7avp5 polypeptide may adopt three kinds of mode of action to play the function of anti HCV, including closed cell and virus infection during early suppression of passivation, And enter the cell passivation virus to inhibit the two infection. In addition, the electrophysiological experiment results showed that p7avp5 polypeptide did not affect the normal assembly and physiological function of P7 ion channel, nor blocked its current, and did not inhibit the release process of HCV from host cells.
In summary, this study found a new natural anti HCV peptide Ctry2459 from scorpion peptides in the repository, by the reasonable optimization design is obtained with high bioavailability of derived peptides and anti HCV function. At the same time, the HCVp7 ion channel basis, design and identification of anti HCV peptide p7avp5 the analysis of the function and mechanism of anti HCV polypeptide. This study found that the anti HCV peptide has potential application value, enrich the development strategy of the existing antiviral polypeptide, and provides a theoretical and practical basis for the development and utilization of natural animal toxin polypeptides and new antiviral peptide selection and design.

【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R512.63;R3416

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本文編號(hào)：1574050