本文選題：酵母展示　切入點(diǎn)：HIV　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)的防治問(wèn)題是當(dāng)今全球臨床研究人員亟需解決的重要課題。由于HIV具有高度變異的特點(diǎn),研究人員在尋找能夠?qū)IV病毒提供具有長(zhǎng)效廣譜作用的中和抗體的過(guò)程中一直面臨著極大的困難。本文將通過(guò)設(shè)計(jì)有效的實(shí)驗(yàn)技術(shù),分離并表達(dá)可與HIV特異性結(jié)合的抗體。為此,需要解決兩個(gè)重要問(wèn)題,如何選擇靶抗原以及如何展示抗體文庫(kù)。 針對(duì)第一個(gè)問(wèn)題,研究人員通過(guò)分析當(dāng)前已經(jīng)找到的HIV廣譜中和抗體,發(fā)現(xiàn)這些抗體對(duì)應(yīng)的病毒抗原表位主要分布在HIV包膜糖蛋白gp120/gp41上的一些保守位點(diǎn)。因此,本課題組研究人員提出了找到合適靶抗原的新方法,即根據(jù)病毒表面的保守表位來(lái)設(shè)計(jì)并合成抗原肽�；谇捌诘难芯拷Y(jié)論,本文提出將靶抗原的設(shè)計(jì)定位于HIV廣譜中和抗體10E8所對(duì)應(yīng)的表位,即gp41近膜區(qū)域(membrane-proximal external region, MPER)上的一段保守位點(diǎn)。同時(shí)根據(jù)此保守位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)合成與修飾,得到與實(shí)際抗原功能相近的一段多肽,從而利用合成的肽段篩選抗體文庫(kù)。 解決第二個(gè)問(wèn)題,需要從眾多的表面展示技術(shù)中,挑選一種用來(lái)展示抗體文庫(kù)。本文選擇酵母表面展示系統(tǒng)進(jìn)行抗體文庫(kù)的展示。一方面,由于酵母細(xì)胞作為真核細(xì)胞,在蛋白質(zhì)翻譯后修飾以及哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)加工等方面具有優(yōu)勢(shì),更適合對(duì)人類抗體片段的表達(dá)及展示。另一方面,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,酵母細(xì)胞也易于培養(yǎng)和進(jìn)行細(xì)胞篩選。同時(shí),本文選取易于基因操作和表達(dá)的單鏈抗體(Single Chain Fragment Variable,scFv)文庫(kù)展示在酵母細(xì)胞表面。在酵母細(xì)胞表面展示了包含有109個(gè)單鏈抗體的非免疫人類單鏈抗體文庫(kù),其中存在產(chǎn)生廣譜中和抗體的基因。 本文提出的實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括如下三個(gè)步驟：首先,對(duì)酵母表面展示的單鏈抗體文庫(kù)進(jìn)行兩輪免疫磁珠分選(Megnetic Activated Cell Sorting, MACS)及兩輪流式細(xì)胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)過(guò)程;其次,從篩選出的抗體文庫(kù)中隨機(jī)挑選30株進(jìn)行基因測(cè)序,對(duì)得到的12株不同單克隆進(jìn)行鑒定,其中有4株為陽(yáng)性結(jié)果克�。蛔詈�,將這4株陽(yáng)性克隆進(jìn)行單鏈抗體的分泌、純化,并進(jìn)一步構(gòu)建載體,將其以全長(zhǎng)形式進(jìn)行表達(dá),經(jīng)再次驗(yàn)證,以全長(zhǎng)形式表達(dá)的抗體仍能夠與抗原肽結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)從酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)展示的單鏈抗體文庫(kù)中,分離和表達(dá)出可與靶抗原特異性結(jié)合的抗體,并建立從酵母表面展示的單鏈抗體文庫(kù)中篩選針對(duì)靶抗原的抗體的技術(shù)平臺(tái)。本文提出的實(shí)驗(yàn)技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景,對(duì)于未來(lái)的疫苗研發(fā)具有重要的意義。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)技術(shù),研究人員可以不斷地設(shè)計(jì)與改造抗原肽,從而找到能夠從抗體文庫(kù)中篩選出廣譜HIV中和抗體的肽段,并將此肽段作為病毒疫苗的前身,指導(dǎo)后續(xù)的疫苗研發(fā)。
[Abstract]:The prevention and treatment of human Immunodeficiency virus (HIV) is an important problem for clinical researchers all over the world. The researchers have been facing great difficulties in finding neutralizing antibodies to HIV that have a long and broad spectrum. This paper will design an effective experimental technique. In order to isolate and express antibodies that can specifically bind to HIV, two important problems need to be solved: how to select the target antigen and how to display the antibody library. In response to the first question, by analyzing the HIV broad-spectrum neutralizing antibodies that have been found so far, the researchers found that the antigenic epitopes corresponding to these antibodies are mainly located at some conserved sites on the HIV envelope glycoprotein gp120/gp41. Our researchers have proposed a new method to find suitable target antigens, that is, to design and synthesize antigenic peptides according to the conserved epitopes on the surface of viruses. In this paper, we propose that the design of target antigen be located in the epitope corresponding to HIV broad-spectrum neutralizing antibody 10E8, that is, a conserved site in the membrane proximal external region of gp41, and the conserved site is chemically synthesized and modified. A segment of peptide was obtained which was similar to the actual antigen function, and the antibody library was screened by using the synthetic peptide fragment. To solve the second problem, we need to select one of the many surface display techniques to display the antibody library. In this paper, we choose the yeast surface display system to display the antibody library. It has advantages in protein post-translational modification and mammalian protein processing, and is more suitable for the expression and display of human antibody fragments. On the other hand, yeast cells are also easy to culture and screen cells during the experiment. The single Chain Fragment variable scFvvlibrary, which is easy to manipulate and express genes, was selected to display on the surface of yeast cell. The unimmunized human scFv library containing 109 scFv was displayed on yeast cell surface. There are genes that produce broad-spectrum neutralizing antibodies. The experimental techniques proposed in this paper include the following three steps: firstly, two rounds of immunomagnetic Activated Cell sorting (Macs) and two rounds flow cytometric Activated Cell sorting (FACSs) were performed on the single chain antibody library displayed on the surface of yeast. From the selected antibody library, 30 strains were randomly selected for gene sequencing, and 12 different monoclonal clones were identified, of which 4 were positive clones. Finally, the four positive clones were secreted and purified by scFv. Furthermore, the vector was constructed and expressed in full-length form. It was proved that the antibody expressed in full-length form could still bind to the antigenic peptide. This technique can be used to isolate and express antibodies that can specifically bind to target antigen from the single chain antibody library displayed by yeast cell surface display technology. A technique platform for screening antibodies against target antigens from single-chain antibody library displayed on yeast surface was established. The experimental technology proposed in this paper has a broad application prospect. It is of great significance for future vaccine development. Through this experimental technique, researchers can continuously design and modify antigenic peptides and find out the peptides that can be screened from antibody libraries to identify broad spectrum HIV neutralizing antibodies. The peptide was used as the precursor of the virus vaccine to guide the subsequent vaccine development.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.91

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